HPLC同时测定蘑菇中五种核苷类成分含量

李 爽，王锦鑫，李 研，张书馨，陈欣良，张 可，王 洁，刁全平，郭 华

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院，辽宁 鞍山 114007)

核苷类化合物是生命体最基本的元素之一，参与人体细胞能量、结构和功能调节作用，具有抗血小板凝聚、增强人体免疫力和抗病毒等多种活性功能[1-3]。蘑菇在欧洲被称为“植物肉”，在日本被称为“食品的巅峰”，许多国家把蘑菇看成“菜中之王”，具有极高的食用价值和药用价值[4-5]。核苷类化合物是蘑菇中的生物活性物质之一，因此本实验对几种蘑菇中的核苷类化合物进行HPLC分析[6-7]，为今后研究蘑菇中的核苷类成分提供一定参考价值。

1 仪器、试剂与材料

仪器：1525型高效液相色谱仪，配2996型二极管阵列检测器(美国waters公司)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；CQX25-24超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)；LFP-800T 粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；沃特浦分析型纯水机WP-UP-LH-10(成都市苏净科学器材有限公司)。

试剂：胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷标准品(合肥博美生物科技有限责任公司)，甲醇(色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司)。

材料：滑子蘑、香菇、草菇、杏鲍菇、松乳菇、杨树菇、榛菇、银耳、木耳(2018年购于鞍山市)，阴干，粉碎过80目筛保存备用。

2 方法与结果

2.1 蘑菇中核苷类化合物的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱，Supersil ODS2 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇-水梯度洗脱：甲醇(A)-水(B)：0→10 min 1%～5%A；10→15 min 5%～15%A；15→20 min 15%～20%A；20→30 min 20%～30%A；流速，1.0 mL/min；检测波长，259 nm；柱温，30℃；进样量10 μL。

2.1.2 标准品溶液的制备

精确称取胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷五种标准品各2.5 mg，用水定容至25 mL容量瓶中，得混合核苷标准品溶液，各核苷标准品浓度均为100 μg/mL，冰箱保存备用。

2.1.3 样品溶液的制备

精确称取9种蘑菇样品各1 g于锥形瓶中，加30 mL水超声提取30 min，抽滤，滤液转移至100 mL容量瓶后用水定容，0.45 μm滤膜过滤，待测。

2.1.4 测定方法

按2.1.1 色谱条件下的测定方法对标准品和样品溶液进行HPLC分析，其标准品和样品HPLC 色谱图如图 1和图2所示。

图1 标准品色谱图

图2 样品(香菇)色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线考察

表1 五种核苷的线性关系

取2.1.2项下的混标溶液，稀释按浓度梯度进样分析，纵坐标为进样峰面积(y,AU*S)，横坐标为标准品的进样浓度(x,μg/mL)。结果见表1，表明5种核苷的标准曲线在10 ～100 μg/mL的线性范围内关系良好。

2.2.2 精密度考察

取2.1.2项下的同一浓度混标溶液，重复进样6次，测定混合核苷溶液的峰面积，计算胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷各自的相对标准偏差，分别为1.21%、0.54%、0.61%、0.53%、1.31%。通过实验数据可以看出，该实验的精密度良好。

2.2.3 稳定性考察

选择香菇样品做稳定性实验，将已制备好的香菇样品溶液进行HPLC分析，在0、3、6、9、12、24 h测定峰面积，计算香菇样品中胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷相对标准偏差分别为0.43%、0.72%、1.14%、1.37%、0.96%。从实验结果可以看出，24 h之内各核苷化合物稳定，可以进行色谱分析。

2.2.4 重复性考察

准确称量香菇样品6份，按照2.1.3方法进行处理，再按照2.1.1的色谱条件进样10 μL，测定五种核苷的峰面积，计算相对标准偏差，香菇样品中胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷相对标准偏差分别为1.43%、1.32%、1.22%、1.33%、1.25%，该方法的重复性良好。

2.2.5 加标回收率试验

精确称量3份香菇样品,每份1 g，加入相应的核苷对照品，按照2.1.3方法进行处理，测定加标回收率。测得胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的平均回收率分别为98.78%、100.57%、100.05%、99.89%、100.13%，相对标准偏差分别为2.95%、2.83%、2.31%、3.09%、2.73%，能够满足分析要求。

2.3 样品的测定

取9种蘑菇样品粉末1g，按照2.1.3的制备方法，并在2.1.1的色谱条件下进行HPLC分析，以外标法计算样品中各核苷含量，结果见表2。

表2 样品中核苷含量(mg/100g)

3 结论

本实验选择了草菇、杨树菇、松乳菇、香菇、榛菇、滑子蘑、杏鲍菇、银耳、木耳等9种常见的蘑菇，用HPLC测定其中5种核苷(尿苷、肌苷、鸟苷、胞苷、腺苷)的含量，9种蘑菇中胞苷、肌苷、鸟苷含量最高为松乳菇，含量分别为159.54 mg/100 g，257.11 mg/100 g，235.79 mg/100 g，尿苷含量最高为杨树蘑，含量为491.24 mg/100 g，腺苷含量最高为滑子蘑，含量为207.25 mg/100 g，加标回收率在98.78%～100.57%之间，相对标准偏差在2.31%～3.09%之间，该方法可用于HPLC同时测定蘑菇中5种核苷类化合物含量。