超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法检验婴儿护肤品中氟康唑等7中禁用组分

张 贞，吕 所，何光侣

(云南白药集团，云南 昆明 650000)

婴幼儿护肤品由于使用人群特殊，故采用一些富含天然成分、具有高保湿配方的清洁、滋润功能的高度安全产品是必要的选择，这些成分在保护婴幼儿皮肤同时，也为微生物提供了良好的生长环境，如果化妆品受到微生物污染会导致其成分发生改变，将会直接损害婴幼儿皮肤，所以需要构建一个防腐体系[1]。本工作所检测的7种禁用组分均为抗生素药物，可用于构建防腐体系。氟康唑、克霉唑、 萘替芬、联苯苄唑、萘替芬、咪康唑、益康唑和灰黄霉素具有良好的抗菌作用，在临床上常被用于治疗各种因微生物感染引起的病症[2-8]。由此可见这些抗生素类药品，能够起到防腐作用。但长期使用含抗生素的化妆品，会产生药物依赖和皮炎等副作用，最终还成人体疫力的减弱[9]。由于抗生素类药物以上的优势，某些不法厂家很有可能在化妆品中添加此类药物，这将会给婴幼儿生长发育带来诸多健康风险。相关检验者有义务对其开展检验工作。在15年版《化妆品安全技术规范》已对常见抗生素类药物的添加做出检验规定，故此检验方法借鉴此手册[10]。

1 主要仪器与试剂

1.1 仪器

TSQ QUANTIS超高效液相仪(赛默飞)， TSQ QUANTIS三重四极杆质谱仪(赛默飞)，超声仪(FUNGICAB)，电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)，离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，CPA224S分析天平(塞多利斯天平)， ZH-2 BLENDER涡旋震荡器(天津药典标准仪器制造厂)。

1.2 试剂

灰黄霉素，益康唑，咪康唑，克霉唑，氟康唑，联苯苄唑，萘替芬等标准品(纯度大于97%)(中国食品药品检定研究院)，色谱纯乙腈(默克股份两合公司)，硫酸二甲酯(沪试公司)，色谱纯乙酸(国家集团化学试剂有限公司)，三乙胺(安普实验科技股份有限公司)，氯化钠(国家化学试剂有限公司)，氢氧化钠(上海回赫维化工)。

饱和氯化钠溶液：称取上述氯化钠40 g，置于250 mL磨口锥形瓶中加入100 mL水超声15 min即可。

0.3 mol/L氢氧化钠溶液：称取上述氢氧化钠1.2 g，置于250 mL烧杯中，加入100 mL水，用玻璃棒搅拌至溶解即可。流动相的配制：

流动相A：0.1%乙酸；

流动相B：乙腈(含有0.1%乙酸)。

混合标准储备溶液：精确称取灰上述黄霉素、克霉唑、益康唑、咪康唑、联苯苄唑、萘替芬各10mg，置于同一10 mL容量瓶中，加上述乙腈稀释溶解并定容到刻度线，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的混合标准储备溶液。

2 实验及结果讨论

2.1 实验方法

2.1.1 混合标准储备溶液的制备

混合标准储备液，用乙腈配制浓度为10，25，500，100，300，500 μg/mL的混合标准系列溶液。

2.1.2 样品前处理

精确称取样品0.5 g 置于25 mL具塞比色管中，加入已配制好的饱和氯化钠溶液1 mL，涡旋30 s，加入乙上述腈),20 mL，涡旋30 s，超声提取30 min，涡旋30 s，加入乙腈定容至刻度，4500 r/min离心5 min，取上层清液经0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液转入液相小瓶作为待测液。

2.1.3 基质标准系列溶液的制备

精确称取取空白样品0.5 g，置于25mL具塞比色管中，分别加入已配制好的混合标准系列溶液50 μL，按照以上样品前处理步骤进行前处理，即得到浓度为1、2.5、5、10、30、30、50 μg/g的未衍生化基质标准系列溶液，然后吸取部分，转入液相小瓶。

2.1.4 仪器条件

2.1.4.1 色谱条件

色谱柱：C8柱(100 mm×2.1 mm×3.5 μmm)；

流动相的梯度洗脱程序：由于7种化合物的极性差别较大故采用梯度洗脱。

表1 流动相的梯度洗脱程序

流速：0.4 mL/min；柱温：30℃；进样量：1 μL。

2.1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；

监测模式：正离子监测模式；

喷雾压力：40psi；

干燥气流速：10 L/min；

干燥气温度：350℃；

毛细管电压：4000 V；

0～1.5 min：不进入质谱仪分析，1.5～9 min：进入质谱分析。

2.1.5 样品测定

将上述已装有样品溶液和对照品溶液的液相小瓶放到液质联用仪中，各吸取1 μL注人液质联用仪，依据上述测定条件分别进行加入分析。

2.1.6 结果判断

2.1.6.1 定性判断

用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判断，在同一试验条件下，供试品应该呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被检测组分的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应组分的质量色谱峰保留时间一致；样品色谱图中所选择的监测离子的相对丰度比与相对浓度标准溶液离子对相对丰度比的偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的禁用组分[11]。

2.2 结果与讨论

2.2.1 质谱条件优化

分别将7种对照品进行质谱条件优化，采用正离子监测模式，得到各组分的透镜电压，各筛选出两个响应最佳的子离子及其相应的最佳碰撞电压(CE)，响应最强的作为定量离子，次强为性。各化合物优化结果见表3。

表3 各化合物优化结果

图1 (1)克霉唑母离子透镜电压优化图，(2)克霉唑碰撞电压优化图，(3)克霉唑二级子离子质谱图

图2 (1)萘替芬母离子透镜电压优化图，(2)萘替芬碰撞优化图，(3)萘替芬子离子质谱图

图3 (1)氟康唑母离子透镜电压优化图，(2)氟康唑碰撞电压优化图，(3)氟康唑子离子质谱图

图4 (1)联苯苄唑母离子透镜电压优化图，(2)联苯苄唑碰撞电压优化图，(3)联苯苄唑子离子质谱

图5 (1)灰黄霉素母离子透镜电压优化图，(2)灰黄霉素碰撞电压优化图，(3)灰黄霉素二级子离子质谱图。

图6 (1)益康唑母离子透镜电压优化图，(2)益康唑碰撞电压优化图，(3)益康唑二级子离子质谱图。

图7 (1)咪康唑母离子透镜电压优化图，(2)咪康唑碰撞电压优化图，(3)咪康唑二级子离子扫谱图

图1～7为各对照品的母离子透镜电压优化图，碰撞电压优化图和子离子质谱图。如图所示，在该实验条件下，从图中选出个组分响应最佳的母离子透镜电压，两个最佳响应子离子及其最佳的碰撞电压。

2.2.2 样品测定结果

相应对照品及样品提取离子流图见图2、3，样品提取离子流图和对照品离子流图中相同颜色的离子流代表同一物质的检测。(图中从上往下序号：1克霉唑，2萘替芬，3氟康唑，4联苯苄唑，5灰黄霉唑，6益康唑，7咪康唑)。7个组分分别在不同的通道进行检测，对单一特征离子对具有专一选择性，不会产生互相干扰的结果；而该模式下所得到的二级离子质谱图具有的独特性可以作为进一步比对和验证的依据，从而增加了判断被检测样品是否含非法添加的可靠性。

图2 对照品提取离子流图

图3 样品提取离子流图

由图2、3可知，在同一实验条件下，被检测的样品的质量色谱峰与对照品溶液中对应组分的质量色谱峰保留时间一致时未出现相同色谱峰，此外在多反应离子监测的模式下也未出现与对照品子离子质谱图(图1～7(3))一致的离子对的响应信号。进一步确认该批次化妆品中不含有禁用组分。由于多反应监测模式具有检测速度快，扫描方式专属性强，故在液质联用技术中常用于非法添加物的定性检测[10-11]。

3 结论

本工作使用了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法快速检测化妆品中禁用组分，耗时较短，操作简便，可进行化妆品检验的批处理，大大提高了检测效率，此外还具有较高灵敏度、较高精密度和高准确率的特点。所以是一种非常可靠地分析技术。