生物体微塑料提取方法比选研究

吴文楠,高俊敏,沈 茜,姚力芬,安立会

生物体微塑料提取方法比选研究

吴文楠1,2,高俊敏1,沈 茜2,姚力芬2,安立会2*

(1.重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400045；2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012)

微塑料(<5mm)在淡水、海洋以及陆生生物体内被广泛检出,但由于提取方法不一致,限制了现有数据之间的可比性.本研究比选了4种消解方法对鱼胃等7种组织的消解效率,并通过显微镜检查、重量、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和拉曼光谱综合评估不同提取方法对10种环境微塑料形态、重量和光谱特征的影响.结果显示,消解效率依次为10%KOH>RIPA组织裂解液＋蛋白酶K>蛋白酶K>30%H2O2.另外,4种消解处理后PA(聚酰胺)颗粒重量均显著增加,H2O2处理后PU(聚氨酯)颗粒颜色略有变化,可生物降解塑料溶于10%KOH,而其他塑料处理前后重量和形态均未变化;4种消解处理前后所有塑料的红外光谱与拉曼光谱均未发生改变.综合以上,推荐以10%KOH为消解液,50℃、180r/min温育振荡6h作为分离提取生物组织微塑料的首选方案.

微塑料；生物；分离；消解效率；10%KOH

微塑料是指直径小于5mm的塑料颗粒[1-2],其来源可分为原生微塑料和次生微塑料.原生微塑料是指向产品中直接添加的塑料颗粒,包括制造塑料制品的颗粒以及化妆品、去角质产品、家用产品等中含有的微珠;次生微塑料是指进入环境的大块塑料在光照射老化、生物破碎、机械磨制等作用下破碎成尺寸更小的塑料颗粒[3-6].微塑料与饵料生物尺寸相近,一旦被生物摄食后,可能会堵塞消化道,阻碍生物摄食并对消化道组织产生病理损伤[7-8].因此,2015年微塑料污染被第二届联合国环境大会列入环境与生态科学研究领域的第二大科学问题.为揭示环境微塑料对生物体健康影响及其潜在生态风险,急需建立分离提取生物体微塑料的可靠方法.

目前,提取生物组织中微塑料的方法有直接观察法[9-10]、酸消解(HNO3、HClO4)[11-12]、碱消解(KOH、NaOH)[2,11]、强氧化剂消解(H2O2、NaClO)[13-15]和酶消解(蛋白酶K、Corolase 7089(AB酶))[11-12].其中,由于生物消化道内存在大量内容物,直接观察法在显微镜下很难确认微塑料[10],并且纤维和颗粒也易被泥沙、胃容物等掩蔽造成丢失或遗漏,而仅凭主观判断是否为微塑料也缺乏科学性[16].国际海洋考察委员会(ICES)[17]曾推荐了1种由HNO3和HClO4(4:1)混合物组成的酸性消解程序,但HNO3等强酸会破坏某些聚酰胺和聚氨酯类塑料[11-12,18-19],导致分析结果不能真实反映环境真实情况,不同监测数据之间的科学价值无法体现,限制了不同处理方法之间获取数据的可比性.

为充分发挥环境监测数据的科学价值、加强监测数据之间的可比性,本研究拟探索一种经济高效且耗时较短的微塑料提取方案,既能满足完全消解鱼、贝等生物组织的要求,又不破坏塑料材质本身的结构和光谱特征.在已有研究基础上,又通过分析4种消解液对不同生物组织的消解效率,评估4种提取方法对塑料材质的形态和重量的影响,并通过比较其对塑料光谱特征的影响以期提出一种能够快速分离提取生物体内微塑料颗粒的方案,为开展环境微塑料相关研究奠定方法学基础.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:生物体视显微镜(M165FC,德国Leica公司),变频摇床(BHWY-211,宁波海曙赛福实验仪器厂),电子分析天平(XS105DU,瑞士Mettler Toledo),真空抽滤系统(GM-0.33A,天津津腾公司).

试剂:NaCl(分析纯),H2O2(30%),KOH(分析纯),ZnCl2(分析纯)购于国药化学试剂(北京)有限公司,RIPA裂解液(50mmol/L Tris(pH 7.4), NaCl (150mmol/L), Triton X-100(1%),脱氧胆酸钠(1%),十二烷基硫酸钠(0.1%))购自Sigma-Aldrich,蛋白酶K溶液(20mg/mL)购自上海生物工程有限公司.

1.2 材料采集

本研究选择了9种常见塑料材质颗粒(Goodfellow公司)和当前市场上1种可生物降解保鲜袋(新疆康润洁环保科技股份有限公司)进行测试,9种塑料颗粒包括:乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA,(4.82±0.23)mm),高密度聚乙烯(HDPE,(4.74± 0.27)mm),低密度聚乙烯(LDPE,(4.43±0.21)mm),聚酰胺(PA-6, (2.80±0.25)mm),聚碳酸酯(PC, (3.81± 0.16)mm),聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET, (4.46±0.36) mm),聚丙烯(PP,(4.07±0.50)mm),聚苯乙烯(PS,(3.73± 0.24)mm),聚氨酯(PU,(3.72±0.39)mm).可生物降解保鲜袋为PLA+PBAT,(3.94±0.34)mm.

1.3 消解液对生物组织的消解效率

将由北京市朝阳区某农贸市场购买的新鲜鲢鱼和白蛤,解剖分离鲢鱼肌肉、肝脏、胃肠和鳃以及白蛤整个软体部,去除内含物后用超纯水清洗3次,自然阴干并备用.分别称取鲢鱼肌肉(5.00±0.01) g、胃(5.00±0.01) g、肠(5.00±0.01) g、肝脏(3.00±0.01) g、鳃丝(2.00±0.01) g、鳃弓(2.00±0.01) g以及白蛤软体部(4.48±1.47g)并剪碎,按照下述方法加入消解液:方案A,按1:30(重量体积比,g/mL)加入对应体积的KOH(10%,/)溶液[4];方案B,按1:30(重量体积比,g/mL)加入对应体积的H2O2(30%,/)溶液[14];方案C,按1:30(重量体积比,g/mL)加入对应体积的超纯水,再按1:90(重量体积比,g/μL)加入蛋白酶K(20mg/mL)[11];方案D,按1:30(重量体积比,g/mL)加入RIPA组织裂解液,再按1:90(重量体积比,g/μL)比例加入蛋白酶K(20mg/mL)[20].将消解体系(每组3个平行)置于恒温箱中震荡6h [(50.0±0.1)℃,180r/min],然后将消解液用5µm尼龙滤膜过滤,经充分吸水干燥后称滤膜总重.按照式(1)[4]计算消解效率(%,DE).

式中:F为消解处理后滤膜的重量,g;F为消解前100片滤膜的平均重量,g,BO为处理生物样品重量,g.

1.4 塑料材质的消解与提取

利用以上4种消解液处理10种塑料材质颗粒,即将塑料颗粒(=30)完全浸入30mL消解液,在50℃下恒温震荡处理6h,每个处理设置3个平行.其中包括9种未着色的颗粒状塑料颗粒:EVA, LDPE, HDPE, PA-6, PC, PUR, PP, PET, PS以及1种块状可生物降解塑料.待实验结束后,将消解液过5µm不锈钢滤膜,然后将滤膜置于50mL玻璃3角瓶,并加入30mL的ZnCl2溶液(>1.50g/mL).室温下超声20min,倒出上清液备用.重复上述浮选过程3次,并将所有上清液过5µm尼龙滤膜,显微镜下观察计数.根据式(2)计算回收率(%,r),其中2为消解后塑料颗粒数,1为消解前加入塑料颗粒数(1=30).处理前后的塑料颗粒使用便携式数码显微镜(#44302-A,星特朗)测量塑料粒径并拍照存档.

1.5 鉴定及光谱分析

将处理前后的塑料颗粒通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)和显微共焦激光拉曼光谱分析:将塑料样品直接置于ZnSe晶体上,使用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700,美国Thermo公司)分析,检测器是DLaTGS KBr,光谱分辨率4cm-1,扫描次数64次,波数650~4000cm-1;另外,将塑料颗粒置于显微共聚焦激光拉曼光谱仪(Renishaw inVia,英国雷尼绍公司)分析,激光波长785nm,功率<10mW,50×长焦物镜,光栅1200l/mm,曝光时间10s,波数120~3200cm-1.通过比较消解前后拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱特征,评估4种方案对塑料材质光谱特征的影响.

1.6 实验的质量控制

所有材料及装置包括玻璃器皿、抽滤装置、解剖工具等使用前均用超纯水冲洗3次,在不使用时立即用铝箔覆盖以减少空气污染.所配制4种消解液均用1µm的玻璃微纤维滤膜过滤后使用.每种处理各设置3个空白对照确保实验质量.

1.7 统计分析

使用SPSS 24.0软件和R软件进行数据的统计分析,检验样品消解效率数据的方差同质性,并相应地选择参数或非参数测试,使用正态方差(ANOVA)或非参数Steel-Dwass test检验以分析4种提取方案消解效率的差异,用成对样本检验分析4种提取方案消解前后塑料颗粒质量的差异,<0.05视为具有显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 消解效率

4种消解液对不同生物组织表现出不同的消解效率(图1).方案A能够消解实验用各种生物组织,平均消解效率高达(97.63±4.09)%,尤其对鱼胃、肠以及白蛤软体部的消解效率更是高于99%.消解后生物组织没有明显残留,消解液过滤时没有明显堵塞滤膜.Karami等[21]研究表明,10%KOH在40℃条件下温育48~72h即可有效消解鱼组织,消解效率大于95%,但本研究在将温度提高至50℃后消解6h,各种生物组织的消解率就可达97%以上,说明提高消解温度能够加速生物组的消解速度.方案B对7种生物组织的平均消解效率仅为(65.95±14.93)%,并且反应过程中释放大量气泡,而残留的生物组织会堵塞滤膜,后期抽滤时间明显延长.其他研究也发现了相似的现象,如孙浩然[22]在室温下使用H2O2消解鱼体消化道组织,也发现组织消解不完全并且产生大量气泡;Karami等[21]分别在室温和40℃下用35%H2O2消解生物组织96h后,均发现有部分生物组织残留.方案C(蛋白酶K)对于鱼肌肉、肝脏、肠以及白蛤软体部组织的消解效率大于90%,但对鱼胃、鳃弓等组织的消解效率却低于60%,各组织的平均消化效率仅为(82.65±18.72)%,表明单一的蛋白酶消解液对部分生物组织并不适用.与方案C相比,方案D对各生物组织的平均消解效率为(92.94±11.17)%,要高于单一蛋白酶K的消解效率.其中对鱼肌肉、肝脏、肠、鳃以及白蛤软体部等组织的消解效率也是高达(99.06±0.05)%,与Karlsson等[23]利用蛋白酶消解液消解褐鳟()胃肠道、粪便物质以及贻贝软组织结果相似.Catarino等[11]在60℃下利用Corolase酶消解贻贝软组织的消解效率近100%,本研究使用蛋白酶消解白蛤软组织消解效率也高达(99.31±0.47)%.但方案D对鱼胃组织的消解效率仅为(71.00±5.62)%,消解后溶液中仍有明显的组织残留,说明酶与缓冲液的组合并不适用于各种组织.

图1 4种消解液的消解效率

将4种方案的消解效率检验方差齐性后进行Steel-Dwass检验(补充材料表S1),方案A(10%KOH)和方案D(RIPA组织裂解液+蛋白酶K)的消解效率显著优于方案B(30%H2O2)(<0.05),方案A与方案C(蛋白酶K)的消解效率有差异但不显著(0.10>> 0.05),其余各组之间的消解效率差异均不显著(> 0.05).因此,方案A(10%KOH溶液)在50℃、180r/min温育振荡6h对各生物组织的消解效率最优,可以作为消解生物组织的首选方案.方案A和方案D的消解效率差异不显著(>0.05),方案D也能消解大部分生物样品,可以作为消解生物组织提取微塑料的备选方案.

表1 消解液对9种塑料材质重量影响(%)

注:√:无变化; *:<0.05.

2.2 不同消解液对塑料材质的影响

2.2.1 消解液对塑料重量影响 由于可生物降解保鲜袋重量较轻(接近分析天平称量下限),故而不对其进行称重,其他9种塑料颗粒经4种消解处理和密度浮选后,所有塑料全部回收,回收率均为100%.经配对检验,聚酰胺(PA) 重量显著变化(<0.05),方案A、B、C、D分别增加(3.74±0.80)%,10.02±1.94%, (7.12±0.25)%,(7.12±0.31)%,这可能是由于PA分子结构中含有亲水性的酰胺基,其表面具有很强吸附能力而吸附消解液成份[24].其他8种塑料材质经4种消解液处理后重量无显著变化(>0.05)(表1).

Dehaut等[4]将塑料加入10%KOH溶液在室温(21±2)℃下温育3周后未发现重量变化,与本研究结果基本一致,但将塑料加入同为碱性消解液的NaOH(10M)在60℃下温育24h,醋酸纤维和PC几乎完全溶解,PET重量也减少约50%.Ender等[25]使用饱和KOH溶液处理后EPS和PTFE溶解.以上研究说明高浓度碱会引起塑料材质溶解.Avio等[18]发现尼龙纤维可被35%HNO3完全溶解,而PET和HDPE颗粒也被部分溶解,回收率仅为4%,因此强酸也不适合用于提取塑料.Roch等[26]通过先加入一定体积NaOH溶液(1mol/L),随后加入3~4倍体积的浓硝酸(65%)共同处理,可快速消解生物组织,但消解后PA完全溶解,PET重量减少(15.8±3.3)%,并且PET和PVC颗粒颜色也发生了变化,说明高浓度强酸如HNO3、HCl以及高浓度强碱如NaOH等均不适用于生物体微塑料的提取.另外,当前监测环境微塑料结果多以单位体积或重量中微塑料的个数表征环境微塑料的污染现状,而Simon等[27]提出可用单位体积或重量环境介质中微塑料重量反映环境微塑料污染水平,这时就需要考虑微塑料吸附环境物质后对微塑料重量的潜在影响,以免放大微塑料污染水平.

表2 消解液对10种塑料尺寸的影响(%)

注:√: 尺寸变化小于1%; ×:全部溶解.

2.2.2 消解液对塑料颗粒形态的影响 对测试的10种塑料材质,可生物降解塑料在10%KOH处理后完全溶解,PU颗粒经H2O2处理后表面由无色透明变为浅黄色,而其它塑料材质表观均无明显变化,而Li等[28]也发现30%H2O2处理会导致塑料颗粒变色.目前微塑料分离筛选主要依赖镜下分选后再进行光谱分析,并且塑料颗粒颜色也是一种表征结果的指标,因此颜色的变化可能会影响现有研究数据之间的综合对比.

对于消解前后塑料平均粒径变化(表2),不同方案消解处理后,粒径变化增减不一,经方案A处理后PA和PU塑料粒径分别减少(1.45±0.70)%和(1.43± 0.64)%,而PET尺寸反而增加(1.54±1.29)%;方案B处理后,LDPE尺寸下降(1.42±1.93)%,而

PET粒径增加了(1.82±1.98)%;方案C处理后,HDPE、PA、PU粒径均有不同程度减小,但均小于3%;方案D处理后,PU和生物可生物降解保鲜袋分别减小了(3.83± 1.10)%和(1.11±0.78)%,其余各种处理对塑料颗粒尺寸无明显影响(£1%).总体上看,除可生物降解塑料外均无明显溶解现象,各种消解液处理后塑料的尺寸变化均小于5%,处于可接受水平.PA塑料经处理后重量显著增加,但塑料尺寸却没有明显增加,说明并未因吸附消解液而发生膨胀.同样, Roch等[26]利用碱和酸混合消解后,EPS颗粒的表面积显著下降,LDPE,PET,PVC-P和PVC-U颗粒表面积显著增加.本研究中PET等表面积也略有增加.由于PET材质具有优良的物理机械性能,如较强的抗蠕变性、耐疲劳性、耐摩擦性,尺寸稳定性好,因此消解处理后粒径变化更可能是由于消解前后测量颗粒粒径位置差异导致的随机误差.

图2 HDPE塑料样品消解前后红外光谱特征

2.2.3 傅里叶红外光谱特征 塑料颗粒经4种方案处理前后傅里叶红外光谱仅略有变化,但特征峰未发生变化(图2,补充材料图S1-S9).EVA颗粒经方案D处理后,1739.39cm-1峰相对强度降低,并且1371.11cm-1处峰消失,1239.99cm-1峰位置发生改变,这种变化可能表明聚合物结构的降解包括聚合物链的重排和聚集[29].LDPE颗粒经方案B处理后,1563.10cm-1处峰位置发生微小改变,且有增加杂质峰;方案C处理后1563.10cm-1处峰消失, 1637.92cm-1处峰位置发生改变;方案D处理后1563.10cm-1处峰消失,1637.92cm-1处峰相对强度降低.PC颗粒经方案A处理后,1638.07cm-1峰相对强度降低,3268.46cm-1处峰消失;经方案B处理后1561.38,3268.46cm-1处峰消失;经方案C处理后1561.38,1638.07,3268.46cm-13个峰消失.PS经方案D处理后3268.46cm-1处峰消失,1281.94cm-1峰位置改变.对于PP,方案C处理后367.87cm-1峰位置发生变化.经方案D处理后,1367.87cm-1峰相对强度降低,1241.25cm-1峰消失,1281.94cm-1峰偏移;另外,经消解处理后多组材质增加了3185cm-1C—H和1745cm-12处峰,分别对应伸缩振动(—CH2—)和羰基(—C=O—),在多组样品处理后1634cm-1峰增加或消失,对应为双键(C=C)的伸缩振动[29].

图3 HDPE塑料样品消解前后拉曼光谱

由上可知,经过4种不同消解液处理后,塑料红外谱图发生的变化可能是塑料分子结构发生了细微变化(如聚合链置换和聚合),但主要特征峰形和指纹峰并未发生改变.通过与标准光谱图数据库检索比对,仍可准确识别塑料颗粒材质.有研究表明[16,26,30],即使HNO3等强酸性消解液会溶解塑料,但对消解后残留塑料颗粒进行FT-IR光谱分析,仍可准确识别颗粒材质.Collard等[16]评估了9%NaClO、65%HNO3和CH3OH对微塑料的降解作用,结果表明塑料虽发生一定程度溶解,但光谱特征分析结果显示聚合物化学成分并未受到影响.Avio等[18]使用15%H2O2消解高分子聚合物,结果发现消解后PE红外光谱与标准谱图匹配率为93%,PS的匹配率高于87%,说明塑料材质的化学特性未受到影响.因此消解处理后塑料材质即使发生轻微溶解或变形,仍可通过红外光谱特征准确识别塑料颗粒材质.

2.2.4 拉曼光谱特征 与处理前相比,4种消解液处理后9种塑料材质(生物降解塑料发生溶解)的拉曼光谱强度均略有改变(图3,补充材料图S10-S16).这可能有2个原因:一是颗粒在形态、粗糙度或取向方面的不均匀性导致光谱强度波动[31],二是由于塑料材质在化学处理后聚合物分子改变所导致[16].除了光谱强度发生变化,还有1些峰消失或发生偏移,如EVA经方案D处理后627.302cm-1峰消失, 1416.86cm-1峰相对强度增加,1438.78cm-1峰相对强度降低;HDPE经方案D处理后,1415.82和2882.61cm-1处峰的相对强度降低;LDPE经方案B蛋白酶K处理后,1061.96,1127.60,1294.10和2882.61cm-14个峰发生了偏移,但均能与处理前的谱图实现正确匹配.同样,Enders等[25]用拉曼光谱分析酸处理后的塑料颗粒光谱特征,发现尽管塑料颗粒表面形态发生变化,但拉曼光谱并未显示出明显的可见变化.

2.3 提取生物体微塑料流程建议

在实际操作中,各类环境生物样品肠胃组织中常常会存在泥沙等无机颗粒物(如梭鱼肠道中会有大量泥沙),难以通过消解完全去除,就会影响后续微塑料的识别和鉴定.基于本研究结果,初步提出在分离提取生物组织中微塑料的具体流程,包括样品前处理、样品消解、密度浮选分离、显微镜检查和鉴定分析(图4).对于提取环境微塑料材质鉴定,由于拉曼光谱易受到荧光干扰,具有低信噪比等缺点[32-33],因此建议有较强荧光背景干扰时,首先用傅里叶红外光谱的不同模式开展微塑料材质分析.

图4 提取生物体微塑料推荐实验流程

3 结语

本研究结果表明,10%KOH溶液对7种生物组织消解能力较好,平均消解效率大于97%;H2O2和蛋白酶K消解后,鱼胃、鳃等生物组织仍有大量残留,消解能力不能满足后续分析要求;RIPA组织裂解液与蛋白酶K对鱼胃组织的消解能力较低,也不适于处理所有生物组织样品;此外10%KOH会溶解生物降解塑料,4种消解方案对其他常见塑料的尺寸和形态特征以及光谱特征均未见明显影响,综合以上,建议10%KOH溶液作为分离提取生物组织中环境微塑料的首选方案.

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Comparison of microplastic extraction methods from organisms.

WU Wen-nan1,2, GAO Jun-min1, SHEN Qian2, YAO Li-fen2, AN Li-hui2*

(1.Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China)., 2019,39(10)：4343~4349

Microplastics (<5mm) have been detected in freshwater, marine and terrestrial organisms widely, however, no harmonized method is available which limited the scientific value for these existing investigation data. The present study aimed to compare four kinds of digestion solutions for microplastic isolation from fish and clam tissue, and then to evaluate the effects on 10 kinds of typical plastics of four kinds of digestion solutions by using a group of indicators, including morphological observation, quality change, fourier transform infrared spectroscopy and Raman spectroscopy characteristics. The results showed that the digestive efficiencies (%) were followed as the order: 10%KOH > RIPA tissue lysate + Proteinase K > Proteinase K > 30%H2O2. In addition, PA particle quality increased after treatments, and PU particle colour slight changed after H2O2treatment. Interestingly, the biodegradable plastic particles were soluble in 10% KOH completely. As expected, the infrared spectrum and Raman spectrum of plastic particles did not change before and after treatments, and the plastic particles could be identified based on their spectrum, except for the biodegradable plastic. As a conclusion, the treatment method of 10% KOH at 50°C and 180r/min incubated for 6hours will be recommended as the preferred method for microplastic isolation from biological tissues.

microplastic；organism；isolation；digestion efficiency；10%KOH

X502

A

1000-6923(2019)10-4343-07

吴文楠(1996-),女,重庆江津人,重庆大学硕士研究生,主要从事环境科学研究.

2019-04-06

国家自然科学基金资助项目(21577137);国家重点研发计划(2016YFC1402206)

* 责任作者, 研究员, anlhui@163.com