新疆维吾尔族耳聋患者mtDNA12SrRNA基因A1555G及A827G突变的研究*

徐红霞 盛国强 李彦华

耳聋是临床上最常见的遗传性疾病之一，据统计，一半以上的先天性聋是由遗传性因素造成的[1]，这其中又有1%是由于线粒体的功能障碍而导致的，因此与线粒体功能障碍有关的耳聋约占全部耳聋患者的5‰[2]。我国听力残疾人约有2 004万，按照上述比例计算，我国线粒体相关耳聋患者约有10万人，因此对线粒体相关性耳聋进行研究，具有重大的社会意义和经济意义。氨基糖苷类抗生素致聋分为两种情况，即用药过量致聋和由于个体存在对氨基糖苷类抗生素的敏感因素而致聋。在多种族的家系以及散发患者中均发现mtDNA12SrRNA基因突变发生率较高。氨基糖苷类抗生素致聋患者在我国的发病率为0.035%[3]，并有逐年上升的趋势。

新疆是维吾尔族聚集区，由于民族传统和自然条件，形成了这一区域相对封闭独立的遗传体系。同时，由于新疆地区特异的地域、环境及饮食习惯，导致该地区耳聋的发病具有地域特点。本研究旨在对新疆地区维吾尔族耳聋患者mtDNA 12SrRNA基因突变进行检测，为新疆地区耳聋的防治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 以来自新疆维吾尔自治区喀什、阿克苏、和田等部分边远地区的120例维吾尔族感音神经性聋患者为研究对象(耳聋组)，其中男55例，女65例，年龄3～65岁，平均31±2.3岁。对所有入选病例进行耳科、听力学和全身检查，耳聋前有明确氨基糖苷类抗生素应用史者9例，用药年龄在半岁到2岁之间，具体用药量不详。入选标准：①各种原因引起的单侧或双侧感音神经性听力下降；②伴或不伴遗传家族史；③有或无氨基糖苷类抗生素用药史；③听力下降后伴或不伴有言语功能障碍。排除标准：①有明确的急性或慢性化脓性中耳炎病史，或分泌性中耳炎病史；②有严重的颅脑外伤或耳部外伤史，伤后有意识障碍或颞骨骨折等；③有明显的强声或爆震接触史；④颅内或内耳感染性疾病导致的听力下降；⑤综合征型聋；⑥中耳畸形或其他原因引起的传导性听力下降;⑦中枢性疾病、脑瘫等智力障碍引起的语言障碍。

另收集100例无耳聋家族史且听力正常的维吾尔族健康人作为对照组，男48例，女52例，年龄18～56岁，平均20.8±2.7岁。

1.2问卷调查方法 采用问卷调查形式，初筛调查发放“耳聋调查表”，同时填写知情同意书，对回答不明确者通过电话联系的方式完善相关信息。调查表内容由基本信息、耳聋史、家族史、出生史、个人史(聋前传染病、耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等)、体检(全身及专科体检)等部分组成。对象的遴选(按照有关标准纳入、排除)等工作均由经过培训的专业人员完成。

1.3mtDNA的提取 采集两组受检者外周静脉血2～4 ml，抗凝后保存于4 ℃冰箱备用。用北京百泰克生物制品公司研制的人类血液基因组提取试剂盒，提取基因组DNA，进行mtDNA 12SrRNA基因A1555G及A827G突变检测。

1.4引物设计及多聚酶链反应(PCR)扩增、测序 PCR体系及各组成成分见表1。PCR引物设计(表2)及所用试剂均来自上海生工生物工程技术有限公司。PCR反应条件：mtDNA 12S rRNA基因：95 ℃变性30秒，57 ℃复性1分钟，72 ℃延伸7分钟，共35个循环，反应终止后再72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，PCR扩增产物直接送上海生工生物工程技术有限公司测序。应用NCBI数据库BLAST在线比对测序结果，用DNAMAN软件将产物序列与标准序列比对，找出碱基改变的位点，分析突变情况。发现可疑的突变位点后用Chromas软件读取测序结果的峰图文件，进行确认或排除。

表1 扩增DNA 12SrRNA基因PCR体系的各成分组成

表2 PCR引物序列信息

2 结果

在120例维吾尔族感音神经性聋患者中共检出9例突变患者，包括mtDNA12SrRNA基因A1555G突变者5例(其中3例有氨基糖苷类抗生素应用史)，检出率为4.17%(5/120)，961delT 1例,961insC 1例,A827G转换2例；对照组中仅发现A827G转换1例(图1、2)。

图1 线粒体DNA A827G位点序列分析 箭头所指为mtDNA12SrRNA A827G位点

图2 线粒体DNA1555位点序列分析 箭头所指为mtDNA 12SrRNA A1555G突变位点

3 讨论

1993年Prezant等[4]发现导致人类氨基糖苷类敏感性非综合征型聋的分子病理基础为mtDNA12SrRNA A1555G位点突变。随后的研究发现mtDNA12SrRNA 基因是一个与感音神经性聋相关的突变热点区，而且该基因区域还存在其它突变位点，如：A827G、961 delT/insC、T961 G、T1095C、G1494A等位点。本研究对120例新疆维吾尔族感音神经性聋患者进行mtDNA12SrRNA基因突变检测，结果显示耳聋组中发现5例A1555G位点突变，2例A827G位点突变，961delT 1例,960insc 1例，未发现T961 G、T1095C、G1494A等位点突变；对照组仅发现1例A827G位点突变。

A1555G位点突变是与耳聋有关的最常见mtDNA突变，一般报道阳性率为1%～3%[5～8]。Malik等[9]在印尼的苏拉威西岛75例非综合征型聋患者中，检测到A1555G突变患者4例，A1555G携带率为5.3%；李琦等[10]在25例新疆维吾尔族药物性耳聋患者中发现1例A1555G突变，突变率为4%，其后又在65例新疆地区维吾尔族耳聋患者中发现3例A1555G突变，突变率为4.9%[11]。本研究耳聋组A1555G点突变率为4.17%(5/120)，这5例患者中3例有明确的氨基糖苷类用药史；前期研究[12]发现新疆地区汉族耳聋患者mtDNA A1555G突变率为16.00%(12/75)，维吾尔族为4.55%(4/88),汉族高于维吾尔族，差异有统计学意义。因此，可以推断氨基糖苷类药物的使用是新疆地区非综合征型感音神经性聋发病的最常见原因之一。

有研究[13]认为mtDNA12SrRNA基因的A827G是氨基糖苷类抗生素引起的药物性聋的又一个突变位点。Li 等[14]在164例散发性聋患者中曾发现1 例A827G突变，而在226例对照人群中未发现该突变；Li 等[15]在60例氨基糖苷类抗生素致聋患者中发现2例A827G突变，在68 例非综合征型聋患者中发现3例；陈智斌等[13]也在两个非综合征型聋家系中发现了A827G位点突变，并认为此突变是导致两个中国家系耳聋遗传易感性的分子基础；蔡朝阳等[16]认为872A>G突变是与聋病表型相关的新位点。而本研不仅在耳聋组中发现了2例A827G突变，在健康对照组中也发现了1例A827G突变，故其是致病突变还是良性突变还有待进一步研究。

本研究结果表明新疆地区维吾尔族感音神经性聋患者mtDNA12SrRNA A1555G位点突变为致病突变热点，A827G位点突变是否是导致中国耳聋遗传易感性的分子基础尚待进一步研究。