3个耐盐内生菌对提高杜梨耐盐能力的影响

谈峰，王莹，郭聪，李玉娟

(江苏沿江地区农业科学研究所，江苏 如皋 226541)

改良盐碱地的最佳技术方案是通过绿化降盐，而筛选耐盐碱树木是首选。高耐盐植物非常稀少，而可用种植于中高盐含量土壤的树种则更少，所以，通过一定的技术手段提高中低耐盐树木的耐盐能力是一个好的思路。自然界中生物对外界环境的适应性提高历来有自身适应性提高和外力干扰性提高2种。在植物对不良生存环境的适应性提高中，依靠外力的作用提升是一种非常有效的技术手段，利用菌类与植物的共生关系提高植物在盐碱条件下的生存能力也是一个研究方向。贺忠群等[1]对丛枝菌根真菌提高植物耐盐性的机制进行了研究，认为菌根能促进植物对关键营养元素的吸收与利用，并减缓盐离子对植物的毒害作用。自然界中能和植物形成共生关系的真菌不多，而形成共生且能促进植物提高耐盐能力的真菌就更少了，而在细菌中却有不少耐盐甚至嗜盐的种类。丁新景等[2]研究认为，阿氏芽孢杆菌等根际菌对雪莲的生长具有促进作用，尤其对根系生长的促进作用明显；井大炜等[3]的研究认为，在一定条件下接种蜡样芽孢杆菌能改善碱蓬根际土壤的微环境，在轻度盐胁迫的条件下效果更好。总体而言，在利用天然微生物菌体改良植物耐盐能力方面，所做的研究还不多。杜梨是优秀的耐盐碱树种，但其不适合在含盐量高于0.36%的中度盐碱地种植。我们在研究植物耐盐性的过程中，提取某些高耐盐植物的内生耐盐菌，放大培养后接种到无土基质中，再进行放大培养，用此培养基种植杜梨，观察内生耐盐菌对杜梨耐盐能力的影响。

1 材料与方法

1.1 耐盐菌的获取和培养

在江苏如东海滩浅水处取盐生植物大米草(SpartinaanglicaHubb.)等，在实验室分离植物内生菌并提纯。

分离培养基配方：黄豆50 g，琼脂12 g。黄豆先制备豆浆，然后用含盐量10%的海水兑至1 L，加入琼脂，溶解，灭菌后冷却备用。

扩大培养基配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，马铃薯200 g，琼脂13 g，加含盐10%的海水至1 L，灭菌，冷却，接种。

液体菌种配方：牛肉浸膏20 g，精解蛋白胨15 g，马铃薯2 500 g，黄豆粉15 g，加含盐10%的海水至1 L。按常规液体菌种培养方式进行。

1.2 无土基质的配制

按体积比将木腐菌糠30%、秸秆20%、双孢蘑菇菌糠50%均匀混合。所有菌糠料和秸秆料均腐熟发酵。按体积比20∶1混入耐盐菌液体菌种，水分调节使用含盐15%的海水，堆积培养10 d，备用。

1.3 杜梨种植

以28 cm×17 cm花盆为容器移栽杜梨，根部分带少量心土和洗净2种处理。每样本50株，地径1 cm，定高50 cm，全去叶，以含盐4%的海水喷雾基质表面保持基质湿润。记录植株发芽与情况。生长稳定后，取样测量根系萌发数量与生长长度，以根系萌发并健康生长为指标来确定杜梨成活。

1.4 菌株侵入检测

取新生根分离，检查是否有菌株进入植株。

2 结果与分析

2.1 耐盐菌菌株

从盐生植物大米草等体内分离获得了3个耐盐的菌株，命名为BR1、BR2、BR3。经镜检，这3个菌株均属于细菌类。3个菌的菌株单体球形，被毛，菌落念珠状，光滑。BR3菌株单菌镜检形态见图1。3个菌株的皿培形态见图2，BR1蛋黄色，BR2有油性，BR3乳白色。皿培培养接种20 h菌株开始萌动，48 h菌落成型；液体培养5 d菌液成熟，菌液有臭鸡蛋味，液体表面有沬，中间可见混浊悬浮体。

图1 BR3单菌的镜检

图2 3个菌株的培养结果

2.2 基质

培养成熟的基质手握有黏稠感，稍有弹性，轻微腐臭味，这是耐盐菌在基质中得到进一步生长并成熟的标志。耐盐菌能在基质中存活并先行利用基质的材料是确保两者能完美融合的基础，适当的菌体数量是保证耐盐菌优势菌群的重要基础，只有具备了适当的耐盐菌群数量的基质，才有可能保证在植株栽植后，能够得到有效的侵入与融合。

2.3 杜梨生长情况

杜梨在经过20 d的培养以后，对盐碱的适应性开始出现差异，标志是新生叶的萎蔫和随后的植株死亡。植物根系是维系植物生长的根本，叶片通过光合作用制造植物继续生长的营养，保证植物生长持续。叶片死亡即代表植物失去了获得新生力量的能力。

在植株栽入盆钵后8～10 d，所有植株均开始萌发新芽，并陆续发生新叶。但自21 d开始，陆续有植株的叶片开始萎蔫，最先发生萎蔫的是经BR1菌处理的，至36 d，杜梨所有叶片全枯死；BR2处理中的杜梨洗根苗全部萎蔫，带心土杜梨苗叶片没有萎蔫，但也没有继续生长；BR3处理的洗根和带心土的杜梨苗叶片有生长的现象，标志为新芽顶部开始拉长。

杜梨植入盆体60 d，所有萎蔫植株没有新叶发生，存活新叶的植株新枝明显生长。BR2心土处理、BR3洗根与心土处理杜梨均有新根生长，所有己萎蔫的植株均无新根发生的痕迹。

3个菌株处理基质中BR2、BR3新根生长见图3，表明不是所有的植物耐盐内生菌都对其他植物有效，菌株的适应性筛选很重要。是否正常发生出新生根，是判断植物移栽是否真正成活的主要指标。杜梨在含3个菌株的基质上生根表现差异较大：BR1没有效果，BR2在移栽植株保留有原生土的情况下是能够成活的，但没有原生土则不能成活；而BR3无论是带心土移栽，还是不带心土移栽，均能很好地生根，带心土的生根更好，根系也更发达。

图3 BR2、BR3成活处理的杜梨根系生长

培养90 d，测量杜梨中新生根条数、根长，结果显示，在正常生长新根的处理中，不同菌株对杜梨在高盐基质中的生根数量、生根速度、新生根生长速度影响差异较大(表1)。在高盐条件下，添加了BR3菌株的基质中盆栽杜梨生长较好，在以4%含盐量的海水作为喷灌用水的条件下仍然能够生长，添加BR2菌株的基质上杜梨能够成活，添加BR1菌株的基质上杜梨无法存活。曾广萍等[4]研究表明，AM真菌可以提高植物的耐盐性。BR2、BR3均分离自非杜梨浅海水植物，含有该菌的基质可以促进杜梨在高盐度环境存活并获得生长。

表1 3个菌株的生根结果

2.4 新生根菌株分离

对杜梨新生根组织进行分离培养，在含BR2和BR3菌株的基质上长出的新生根中分离出了耐盐细菌，经拮抗对比试验确认为接入基质的同种菌，说明，此菌是通过基质进入杜梨组织，杜梨借由此菌之力，在高盐基质中萌发新根，从而确保成活。

BR2、BR3均可从培养的杜梨植株新生根中分离到，结合杜梨在高盐基质中的存活与生长情况，可以确定这2个菌株与杜梨形成了共生关系，从而为杜梨在高盐基质中的生存提供了环境保证，张静等[5]研究认为，硫氧化细菌可改良盐碱土中的碱性，通过改善植物生长的pH环境来影响植物生长的条件。杜梨的耐盐极限是0.30%，至0.36%则全死亡[6]。本研究证明，在添加了BR2、BR3的基质中移栽的杜梨，可以在盐浓度4.00%的基质中存活并生长，管理过程以4.00%的海水作为生产管理用水不影响杜梨的生长。

3 小结

植物内生菌是指存活于健康植物组织内部，又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，这可能是由于内生细菌生活在植物组织内部，与宿主植物形成了紧密的共生关系，引发的多种效应的综合结果。本研究中2个菌株的效果良好，这是否与基质本身的高营养有关？而盐碱实地的土壤营养含量很低，BR2、BR3菌株在实地移栽中的效果是否与盆栽一样？一定范围内添加这种基质是否能解决植物在盐碱地中的移栽成活难题？还有待于进一步的研究。