奉贤黄化香樟土壤细菌群落特征

张萍，沈振原，钱佳，金程，徐冰，朱清，何小丽*

(1.上海奉贤园林绿化工程有限公司，上海 200232； 2.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 3.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232)

香樟(Cinnamomumcamphora)为樟科樟属植物，是亚热带常绿阔叶林的主要组成树种，著名的园林绿化树种之一。其观赏性好、抗逆性强、耐修剪，萌芽力强、较好的文化价值使得其成为园林绿化的优势树种之一，广泛应用到公园、绿地、行道树、庭院绿化中，对于改善城市的生态环境发挥了重要作用。香樟体内含有特殊的化学物质，病虫害较少，但由于不少地方重栽植、轻管理、种植频率高、树种单一，香樟黄化越来越严重[1-2]。香樟黄化一般表现：(1)植株叶片不同程度发黄，树势衰弱，严重者叶黄白色、质薄，叶尖与叶缘有焦枯斑，容易受冻害；(2)最初黄化的树叶仅仅在树冠上局部分布，以后数量逐渐增加，以致全冠黄化，严重时嫩梢枯死、枝叶稀疏，树冠萎缩，逐渐衰竭死亡；(3)一般幼树与新移植不久的香樟黄化比例较高，同一病株冬春两季黄化较重，新叶黄化重于老叶。

一般认为引起黄化病病害的原因可分为生物因素和环境因素2大类[3-4]。生物因素是由于病原菌由叶部或他处侵入，干扰了植物的正常代谢，叶片黄化只是作为危害症状从外部显示出来。环境因素黄化是由于土壤中缺乏铁、锌等微量元素或者由于某些元素过剩引起营养失调而导致叶片黄化，管理粗放和一些客观的外在环境因素如光照、水分(包括土壤水和降水)、温度、土壤养分(包括缺铁或者氮、磷、镁、锰等元素含量的比例失调等)、土壤pH、大气污染等综合因子都可以诱导黄化病的产生和发展。针对香樟黄化起因，生物防控一般采用针对地上部分的病虫害农药防治，环境因素控制常采用种植土壤改良处理、叶面喷施硫酸亚铁溶液、根际施用酸性肥料等方法[5-7]。关于香樟黄化的起因研究，国内学者常围绕生物防控和环境因子控制展开研究，对香樟地下部分土壤微生物群落研究较少。本研究采用细菌16S rDNA高通量测序分析方法对黄化香樟土壤中的微生物群落进行分析，探索可能导致香樟黄化的土壤微生物诱因，从而为治理香樟黄化提供科学的解决办法。

1 材料与方法

1.1 样品采集与土壤相关指标的测定

土壤样品分非黄化香樟土壤、黄化香樟土壤、行道树土壤样品，非黄化香樟土壤样品采自小区休憩公园(编号H0-1/0～20 cm土样、H0-2/20～40 cm土样)，黄化香樟土壤样品采集于上海市奉贤区奉柘公路(编号H1-1/0～20 cm土样、H1-2/20～40 cm土样)、小区休憩公园(编号H3-1/0～20 cm土样、H3-2/20～40 cm土样)，香樟行道树土壤采自奉贤主城区行道树树穴(编号H6-1/0～20 cm土样，因树穴土层坚硬，20～40 cm土样未取)。样品采集后作2份处理，1份置于冰箱4 ℃保存供微生物分析用，另1份风干粉碎过筛用于理化指标测定用。

1.2 样品预处理与样品总DNA提取

称取200 mg的样品，放入灭菌的2 mL离心管中，加入1 mL 70%乙醇，震荡混匀，16 000g室温离心3 min，弃置上层液体。加入1×PBS溶液，震荡混匀，16 000g室温离心3 min，弃上层液体。倒置2 mL离心管于吸水纸上1 min，直至没有液体流出。将样品管放入55 ℃烘箱10 min，使残留乙醇完全挥发，保证后续实验操作。具体提取步骤参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用说明书。琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

1.3 高通量测序

采用通用引物(341F/805R)对土样细菌16S rDNA基因的V3～V4区扩增。PCR扩增体系为50 μL，其中含2×Taqmaster Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1 μL、Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL、Genomic DNA 10～20 ng，添加H2O至50 μL。PCR扩增的反应条件为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量,以方便按照1∶1的等量混合后测序。PCR扩增产物利用生工生物工程(上海)股份有限公司的MiSeq PE300测定仪(Illumina Inc.San Diego.CA.USA)完成序列测定。

1.4 生物信息处理

利用Mothur(V.1.30.1)对原始DNA序列进行过滤处理，去除嵌合体，得到优化序列；按照97%相似性将优化序列划分可操作分类单元(OTU)；基于OTU进行稀释性曲线分析，并计算Chao1丰度指数、覆盖度(Coverage)和Shannon多样性指数。利用主成分分析法(PCA)分析各样间OTU相似性。对比Silva(http://www.arb-silva.de/)16S rDNA、18S rDNA数据库，采用RDP Classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个分类水平上统计每个样品的群落组成；利用冗余分析研究土壤化学指标与细菌群落的关系。

2 结果与分析

2.1 细菌群落多样性差异

Shannon指数反映细菌群落alpha多样性指数，Shannon值越大，说明细菌群落多样性越高。由表1可知，非黄化香樟H0-1(0～20 cm)、H0-2(20～40 cm)的平均细菌群落多样性高于H1-1(0～20 cm)、H1-2(20～40 cm)、H3-1(0～20 cm)、H3-2(20～40 cm)等黄化香樟土壤细菌多样性平均值。H6-1(0～20 cm)由于为行道树表层土壤，含有较高的外在添加有机质，促进土壤细菌多样性较高。H6-1为香樟行道树，长势较弱。

表1 奉贤黄化香樟土壤细菌多样性

2.2 黄化香樟土壤细菌属水平分类

由图1可以看出，不同样点以及同一样点不同深度土壤细菌群落结构组成均存在差异。非黄化香樟土壤H0-1、H0-2细菌群落结构组成相近，而黄化香樟(H1-1、H1-2与H3-1、H3-2)同一样点不同深度土壤细菌群落结构差异性较大。微小杆菌属在黄化香樟H3-2中分布最多。假单胞菌属在表层H0-1中分布较多，深层H0-2中分布很少，跟黄化香樟土壤中的假单胞菌属分布相反，表层土样H1-1、H3-1中分布较少，深层土壤H1-2、H3-2中分布较多；假单胞菌属中的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)为植物根际最普遍的微生物类群，作用机制主要有抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等[8-10]；黄化香樟深层土壤假单胞菌属相对数量高于表层土壤，表明深层土壤可能面临病原真菌入侵、营养元素吸收困难等因素，从而激发假单胞菌属的大量增殖。H1-1、H1-2、H3-2中存在一定数量的溶杆菌属，H1-2、H3-2中存在链霉菌属，链霉菌属、溶杆菌属对多种病原真菌、细菌和线虫具有溶菌活性等典型特征[11-15]，表明黄化香樟土壤可能受到病原真菌、细菌或者线虫的入侵，激发溶杆菌属、链霉菌属增加。柠檬酸杆菌属、不动杆菌属在H3-2中分布也较其他样点多。贪铜菌属在H1-2中分布最多，H1-2为奉柘公路两侧开放裸露土壤，车辆排放的重金属渗入道路两侧深层土壤，从而可能促进土壤耐金属贪铜菌属数量的增加，贪铜菌属具有转化和耐受重金属的功能[16-17]。同时H1-1、H1-2、H6-1中存在一定数量的鞘氨醇单胞菌属，该菌具有降解多环芳烃的功能[18-20]，H1-1、H1-2为奉柘公路旁土壤，H6-1为行道树土壤，两者受石油烃和多环芳烃污染较重，促进了土壤鞘氨醇单胞菌属的增殖，加速了有机污染物的降解。

色块高度表示该细菌种类的相对含量，从下而上不同色块依次表示为未分类细菌(unclassified bacteria)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、未命名(GP6)、假单胞菌属(Pseudomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、GP4、不动杆菌属(Acinetobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、溶杆菌属(Lysobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Latescibacteria、Kofleria、聚乙烯醇杆菌属(Povalibacter)、Verrucomicrobia、马赛菌属(Massilia)、链霉菌属(Streptomyces)、沙单胞菌属(Arenimonas)、Lacibacterium属、Gp17、Gp7、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、GP16、小梨形菌属(Pirellula)、Sulfuritalea属等。图1 土壤细菌属水平分类

2.3 细菌群落与土壤化学指标的关系

由于盐碱地植被受土壤pH、电导率、有机质影响较大，因此，在调查黄化香樟土壤性质时，选取pH、电导率、有机质3个化学指标。表2为采样点土壤的化学指标：上海土壤偏盐碱，奉贤区离海岸线较近，距离海岸线较近的为H1-1、H1-2，较远的为H0-1、H0-2、H3-1、H3-2、H6-1；7个土壤样品土壤pH均高于8，电导率介于0.05～0.20，土壤表层有机质含量介于6.26～23.45 g·kg-1。

表2 采样点土壤的化学指标

由图2可以看出，有机质对土壤细菌群落结构影响最大，电导率、pH次之。其中细菌群落结构与有机质、电导率多数呈正相关关系，与pH多数呈负相关关系。

图2 基于OTU的细菌群落与土壤化学指标的冗余分析

3 小结与讨论

物种多样性是维持生态系统正常功能的前提条件，细菌群落的丰富性和多样性在保证营养元素循环、有机物降解、重金属形态转化、土传病害预防等方面具有重要的生态功能。本研究3种香樟土壤类型(非黄化、黄化、行道树)中，土壤细菌群落多样性为行道树香樟>非黄化香樟>黄化香樟；黄化香樟的表层土壤细菌群落多样性高于深层土壤。有机质含量对香樟土壤细菌群落结构影响最大，电导率、pH次之。不同类型香樟土壤细菌种类差异性显著，与每种类型的土壤特性相关。黄化香樟深层土壤中含有一定丰度的假单胞菌属、贪铜菌属、链霉菌属、溶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属细菌，该些细菌种类与土壤有机污染物的降解、重金属转化和土传病害预防紧密相关。同时，也表明香樟黄化或长势不好除了与已研究表明的铁元素缺乏有关外，可能与土壤中的污染物积累、土壤致病菌有关。通过冗余分析表明，有机质可以改变土壤细菌群落结构，因此，可以通过向土壤添加有机质，或者生物有机肥(不同功能菌群，如芳香烃降解菌、重金属耐受菌、生防菌等)来改变土壤细菌群落结构，从微生物群落角度为香樟黄化治理提供一个可行的生物学方法。