干旱和盐胁迫对14个紫花苜蓿品种种子萌发特性的影响

郭 湘，郭一帆，黄思怡，蒲 棋，杨 康，彭 燕

（四川农业大学动物科技学院，四川 成都 610000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)为优良的多年生豆科饲草，具有产量和营养价值高，适口性好和适应性强等特点，素有“牧草之王”的美誉，是国内外栽培最为广泛的饲草之一[1]。我国北方是紫花苜蓿的主要栽培区，也是干旱和盐碱地大量分布区。近年来，受全球气候变暖的影响，我国季节性干旱和土壤盐渍化程度加剧的问题日益突出[2-3]。众多研究报道，干旱和盐碱胁迫可导致紫花苜蓿产量大幅下降，干旱和盐碱胁迫已成为严重制约紫花苜蓿产量稳定和提高的主要限制因子[4-5]。此外，随国内苜蓿产业的快速发展，国内对苜蓿品种的种子需求量不断增长，国内的种子供给存在较大缺口，因此，生产中大量应用引进的国外品种十分普遍，然而，引进品种对干旱和盐碱的耐受性如何需要在利用前进行有效评价以减少由于盲用选用而导致的生产损失。Al-Khatib等[6]的研究表明，紫花苜蓿萌发期和幼苗期对干旱和盐碱胁迫较敏感，生长后期耐性增强。因此，在种子发芽期评价不同品种的抗旱耐盐性并筛选抗性强的品种，对干旱盐碱区合理选用适宜的栽培品种具有重要指导价值。种子萌发阶段是在植物发育过程中的关键时期，种子萌发期的抗性强弱会直接影响之后田间播种出苗的好坏，因此对种子萌发期抗性的评价具有参考价值和实践意义的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

14个供试的紫花苜蓿品种别购自北京克劳沃、丹农种子集团以及四川省凉山州畜牧研究所，品种信息如表1所列。

1.2 试验内容

1.2.1 PEG和NaCl处理的适宜浓度筛选

以‘凉苜一号’的种子为试材，依照国际种子检验规程，不同胁迫处理下萌发率的测定采用培养皿法。本试验随机选取健康的种子，用清水浸泡3 h后均匀放置在铺设有3层滤纸的培养皿中，每皿种子数为50粒，然后置入智能光照培养箱进行发芽，温度为20 ℃恒温，12 h光照/12 h黑暗。设置 0 (CK)、150、200、250、300 mmol·L-1NaCl的溶液和0(CK)、15、20、25、30%的PEG-6000溶液处理种子，每个处理设6次重复，采用称重法补充每天蒸发所失去的水分，以保持溶液浓度的恒定，第10天结束发芽试验。

表1 供试材料Table 1 The selected material

1.2.2 供试紫花苜蓿品种在干旱和盐胁迫下的发芽试验

选取14个品种的健康种子，分别浸泡3 h后，采用1.2.1中筛选出的PEG和NaCl浓度处理萌发期的种子。种子发芽所处的温度和光照条件同1.2.1，每天记录发芽的种子数量。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数

发芽势(germination potential, GP)=4天内供试种子发芽数/供试种子数×100%；

相对发芽势(relative germination potential, RGP)=处理后第4天的种子发芽势/第4天对照种子发芽势×100%；

发芽率(germination rate, GR)=第10天供试种子发芽数/供试种子总数×100%；

相对发芽率(relative germination rate, RGR)=处理后第10天的种子发芽率/第10天对照种子发芽率×100%。

发芽指数(germination index, GI)=G1/N1+G2/N2+…+Gn/Nn。

式中：G1、G2、…、Gn为第1、2、…、n天的发芽数N1、N2、…、Nn为相应的发芽天数。

相对发芽指数(relative germination index, RGI)=处理浓度发芽指数/对照发芽指数。

1.3.2 根长测定

在培养第10天时，每个品种选4组生长情况相近培养皿，每皿随机选取10株苗，4次重复，用直尺测定每株的根长，测定结果以平均值表示[7]。

相对根长=处理后第10天种子根长/第10天对照种子根长×100%。

1.3.3 鲜重的测定

在培养第10天时，每个品种选4组生长情况相近培养皿，每皿随机选取10株苗，4次重复，用万分之一电子天平准确测定10株苗的鲜重，测定结果以平均值表示[8]。

1.3.4 干重测定

将测定好鲜重的10株幼苗放入105 ℃烘箱内10 min，然后降温到65 ℃经过48 h烘干至恒重，再用万分之一电子天平准确称干重，测定结果以平均值表示。

1.4 数据分析

采用Excel 2010进行数据整理；用SPSS 22.0软件对不同品种在同一胁迫处理进行单因素方差分析，并用Duncan方法对所测定数据进行多重比较；用Origin 2018作图。

1.5 综合评价

利用隶属函数法对14种紫花苜蓿的抗旱以及耐盐性进行综合评价。模糊数学隶属函数法计算公式：Yij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。式中：Yij为i品种的j指标的隶属函数值；Xij为i品种的j指标的平均值；Xjmin为各品种j指标平均值的最小值；Xjmax为各品种j指标平均值的最大值；如某一个指标与种子抗性负相关，则用反隶属函数计算抗旱以及耐盐性隶属函数值：Yij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。最后将每个品种的每个指标利用公式计算其隶属值，再将同一指标隶属值累加算其平均值，各项指标隶属函数值累加求平均值。通过比较不同品种的隶属值的总平均值，确定不同苜蓿的耐受胁迫的综合能力，总平均值越大，抗性越强；反之，抗性越弱。

2 结果与分析

2.1 适宜的PEG和NaCl浓度的筛选结果

当PEG浓度为15%和20%时紫花苜蓿的发芽率分别为98.00%和98.40%，略高于对照(96.80%)(图1)，但三者差异不显著(P＞0.05)，表明低浓度PEG处理对紫花苜蓿的发芽率有一定的促进作用。当PEG浓度升高至25%时，发芽率下降为47.20%，与对照及15%和20%处理间差异显著(P＜0.05)。PEG浓度为30%时，种子萌发受到严重抑制，发芽率仅有4.40%。对照和150 mmol·L-1NaCl处理下，的发芽率分别为96.80%和97.20%，差异不显著，表明低盐条件下度有利于紫花苜蓿种子的萌发。当NaCl浓度为 200、250、300 mmol·L-1时，紫花苜蓿的发芽率随浓度升高而显著下降，分别为85.20%、54.00%、8.80%。筛选的结果需要两种胁迫对苜蓿种子发芽率影响程度接近，所以选择250 mmol·L-1NaCl和25%PEG分别作为盐和渗透胁迫的浓度，以测试不同紫花苜蓿品种在种子萌发期对盐和渗透胁迫的耐受性。

图1 ‘凉苜一号’在不同NaCl浓度和不同PEG浓度下的发芽率Figure 1 ‘Liangmu No.1’ germination rate under different NaCl concentration and different PEG concentration

2.2 干旱和盐胁迫下不同紫花苜蓿品种的相对发芽势

发芽势是反映种子质量优劣的指标之一，它可以反映种子生活力的强弱，出苗的整齐程度，发芽势越高，种子生活力越强，出苗整齐，增产潜力也越大。在盐或干旱胁迫下，紫花苜蓿的种子萌发皆受到严重抑制(表2)，平均相对发芽势由对照组的100%分别降至41.37%或43.46%。其中，盐胁迫时，供试品种的相对发芽势为28.63%～61.61%，‘凉苜一号’的相对发芽势最高，为61.61%，‘巨能995’较高，为55.78%，‘巨能7’相对发芽势最低，为28.63%，‘巨能4030’和‘巨能401’较低，分别为33.11%和33.00%。其余品种介于它们之间。干旱胁迫时，供试品种的相对发芽势在31.44%～85.08%，相对发芽势高于49%的有3个品种，‘巨能995’最高，为85.08%，‘莎莎’和‘法多’较高，分别为49.01%和51.30%；‘威斯顿’的相对发芽势最低，为31.44%。以上分析结果说明在盐胁迫下，‘凉苜一号’和‘巨能995’种子生活力强；干旱胁迫下，‘巨能995’，‘莎莎’和‘法多’种子生活力强。

表2 14个紫花苜蓿品种在干旱和盐胁迫下的相对发芽势Table 2 Relative germination potential of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress %

2.3 不同品种的相对发芽率

发芽率是反映种子质量和出苗率的指标[7]，种子发芽率越高，则表明有生命活力的种子比例越高。无论盐胁迫还是干旱胁迫，相对发芽率都呈现下降趋势。在盐胁迫下，14个苜蓿品种的相对发芽率在44.98%～75.91%，其中大部分品种的相对发芽率集中在44%～52% (表3)。相对发芽率高于60%的有3个品种，其中‘凉苜一号’最高，为75.91%；低于50%的有7个品种，‘希模’最低，为44.98%。干旱胁迫下，相对发芽率在42.18%～86.27%，不同品种间差异较大。相对发芽率在60%以上的有7个品种，‘巨能995’相对发芽率最高，达86.27%；相对发芽率在50%以下的有3个品种，‘英斯特’相对发芽率最低，为42.18%，‘威神’和‘凉苜一号’较低，分别为45.75%和45.45%。所以从发芽率这个指标来看，在盐胁迫下‘凉苜一号’抗盐性表现突出，而干旱胁迫下‘巨能995’的抗旱能力相对其余品种尤为突出。

2.4 不同品种的发芽指数

发芽指数可以反映种子的萌发速度和整齐程度[8-9]。在胁迫情况下，各品种的发芽指数均下降(图2)，显著高于其余品种(P＜0.05)。在对照处理中，不同品种间的发芽指数在90%～124%。在盐胁迫时，‘凉苜一号’的发芽指数最高，其次为‘巨能995’和‘法多’。干旱胁迫时，‘巨能995’的发芽指数最高，显著高于其余品种(P＜0.05)，较高的还包括‘希模’和‘法多’。

2.5 不同品种的相对根长

种子萌发时胚根一般是率先突破种皮，具有吸收水分和养分的功能，因此发达的根系是植物耐受胁迫能力的一个重要指标。在盐胁迫下，胚根生长受到严重抑制(表4)，与对照相比，明显变短，14个苜蓿品种的相对根长范围为6.48%～14.67%，‘英斯特’相对根长最长，达到了14.67%；‘威斯顿’相对根长最短，为6.46%，这一结果也与盐胁迫下‘威斯顿’发芽势最低的结果一致。然而，干旱胁迫对胚根生长的抑制作用较小，其中‘莎莎’、‘希模’‘英斯特’3个品种的相对根长值不仅没有变小，反而变大(＞100%)，相对根长大于90%的有5个品种，仅‘巨能4030’的相对根长低于70%。

表3 14个紫花苜蓿品种在干旱和盐胁迫下的相对发芽率Table 3 Relative germination rate of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress%

图2 不同紫花苜蓿品种的发芽指数Figure 2 Germination index of different Medicago sativa varieties

表4 14个紫花苜蓿品种在干旱和盐胁迫下的相对根长Table 4 Relative root length of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress %

2.6 不同品种的相对鲜、干重

就鲜重而言，在两种胁迫下都受到严重抑制，呈现显著下降的趋势。在盐处理下，‘莎莎’相对鲜重最低，为0.07；‘法多’相对鲜重最高，达0.47 (表5)。干旱处理时，‘梅佐’的相对鲜重高达0.57；‘凉苜一号’则低至0.28。在盐胁迫下，‘法多’的相对干重最高，为1.22，‘梅佐’最低，为0.79，其中相对干重大于 1 还包括‘巨能 551’、‘巨能 601’、‘希模’、‘威斯顿’。在干旱胁迫下，‘巨能551’的相对干重最高，为1.47，‘巨能4030’的相对干重最低，为0.96，其中除了‘巨能4030’之外，其余品种的相对干重都大于1，说明干旱胁迫对于苜蓿幼苗积累干物质的抑制作用较小，甚至对于干物质的积累有促进作用。

2.7 不同品种萌发期的耐盐性比较

采取模糊数学隶属函数法，对相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对鲜重、相对干重、相对发芽指数等指标进行隶属函数值计算，并对不同紫花苜蓿品种的耐盐性进行排序(表6)，‘法多’的耐盐能力最强，均值为0.839；其次是‘凉苜一号’和‘巨能 551’，均值分别为 0.743、0.651；‘莎莎’的耐盐能力最差，均值只有0.155，较差的为‘巨能 7’和‘梅佐’，均值分别为 0.239 和 0.248。

2.8 不同品种的抗旱性比较

采取模糊数学隶属函数法，对相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对鲜重、相对干重、相对发芽指数等指标进行隶属函数值计算，并对不同紫花苜蓿品种的抗旱性进行排序(表7)，‘巨能995’ 对渗透胁迫的耐受性最强，均值为0.712；其次为‘希模’和‘法多’，均值分别为0.616和0.585；‘巨能 4030’、‘凉苜一号’、‘威神’的抗旱能力较差，均值较低，分别为0.107、0.213和0.274。

2.9 供试品种抗旱、耐盐性的综合评价

将计算出的各品种抗旱性和耐盐性的隶属函数值综合取平均值，对紫花苜蓿品种的抗逆性进行综合比较排序[10]。结果显示，综合抗性较强的品种有‘法多’、‘巨能 995’和‘巨能 551’；而‘巨能 4030’、‘威神’和‘莎莎’的综合抗性较差 (表8)。

表5 14个紫花苜蓿品种在干旱和盐胁迫下的相对鲜重和干重Table 5 Relative fresh and dry weight of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress

表6 14个紫花苜蓿品种萌发期耐盐性指标隶属值及排序Table 6 Membership value and order of salt tolerance indexes of 14 Medicago sativa cultivars during germination

表7 14个紫花苜蓿品种萌发期抗旱性指标隶属值及排序Table 7 Membership value and order of drought resistance indexes of 14 Medicago sativa cultivars during germination

表8 14个紫花苜蓿品种抗旱、耐盐性的综合评价Table 8 Comprehensive evaluation of drought and salt tolerance of 14 Medicago sativa culitvars

3 讨论

3.1 NaCl和PEG胁迫浓度选择的有效性

有研究表明，在PEG模拟干旱胁迫中，因PEG分子本身不易自由通过植物细胞壁而渗入到活细胞内，众多研究表明，采用PEG渗透剂模拟干旱胁迫是一种经济、有效的方法，而且低浓度的PEG可以通过启动种子体内一系列保护机制，来减少种子吸胀过程中膜系统的损伤，从而提高植物种子发芽率[11]。李志萍等[12]对栓皮栎(Quercus variabilis)种子进行PEG渗透胁迫，发现低浓度促进种子萌发。陈士超等[13]发现PEG浓度为20%时，种子发芽率、发芽势、发芽指数等均小于CK，但是这些指标较CK降低不显著；当PEG浓度高于25% (包括25%)时，以上指标均显著小于CK。宫文龙等[14]报道，低浓度NaCl处理对紫花苜蓿种子萌发有促进作用，高浓度时则严重抑制，其中1.2% (大于200 mmol·L-1)的NaCl浓度可有效鉴别紫花苜蓿品种的耐盐性。本研究也获得类似的结果，150 mmol·L-1NaCl以及15%、20% PEG处理处理时，紫花苜蓿种子的发芽率高于对照。试验筛选的NaCl和PEG处理浓度为250 mmol·L-1和25%，与报道结论[13-14]相近，这一结果为选择适宜的NaCl和PEG胁迫浓度以鉴定紫花苜蓿萌发期的抗旱耐盐性提供了参考。

3.2 紫花苜蓿胚根适应盐和干旱胁迫的策略

干旱胁迫和盐胁迫是两种机制不一样的胁迫，植物耐盐性是由多基因控制的数量性状，因此不同植物耐盐机理会有一定的差异性[15]，盐胁迫主要通过影响细胞内离子稳定和水分平衡进而对植物生生理活动产生影响[16]，在PEG模拟干旱胁迫中，因PEG分子本身不易自由通过植物细胞壁而渗入到活细胞内，且一定浓度的PEG可以通过启动种子体内一系列保护机制，来减少种子吸胀过程中膜系统的损伤，促进植株生长也从而提高植物种子发芽率[17]。马巧利等[18]研究发现，等渗条件下NaCl处理的紫花苜蓿胚根较粗短，而PEG处理的胚根较细长，且NaCl比PEG对紫花苜蓿造成的伤害更大。相近地，在本研究中250 mmol·L-1盐迫胁下，供试的紫花苜蓿胚根生长皆受到显著抑制，相对根长仅为对照的10%左右，而干旱胁迫对胚根的抑制作用较小，14个品种中有3个品种的相对根长比对照长，5个品种大于90%。这些结果表明，紫花苜蓿种子萌发时以不同的策略应对盐和干旱胁迫。

3.3 紫花苜蓿萌发期抗旱耐盐性的综合评价

植物种子发芽能力受众多因素影响。饲草种子的发芽速度和整齐度与牧草生长和产量密切相关。逆境胁迫条件下有效评价种子发芽能力在生长中具有重要指导意义。已有文献显示，评价植物种子发芽能力的方法较多，宫文龙等[14]通过‘打分法’对不同苜蓿品种的耐盐性进行了综合评价，孔令琪等[19]为避免单一指标评价的片面性，用平均隶属函数值法对17个苜蓿品种萌发特性进行了评价，车代弟等[10]通过综合抗旱性和抗盐性隶属函数值取平均值对25种花卉综合抗性进行排序作出评价。本研究中采取模糊数学隶属函数法，对14个紫花苜蓿品种的相对发芽势、相对发芽率、相对根长、相对鲜重、相对干重、相对发芽指数进行隶属函数值计算和排序，再将计算出的各品种抗旱性和耐盐性的隶属函数值综合取平均值，对紫花苜蓿品种的抗逆性进行综合比较排序，以综合评价它们对盐和干旱胁迫的耐受性。

结果显示，‘巨能995’的耐盐性较好，这与马宗琪等[1]认为‘巨能995’为较耐盐品种的结果一致。‘巨能995’和‘法多’的发芽能力在盐胁迫或干旱胁迫中的均表现较好。由于抗旱性和耐盐能力是受多因素影响的复杂数量性状，在种子萌发期鉴定出来的抗性强的品种在苗期乃至整个生命周期是否也表现较强的抗性，还有待进一步研究[20-22]。此外，该研究在中性盐胁迫下进行，而生产中常常是盐碱胁迫同时出现，因此不同品种的耐盐碱能力也有待深入探明。在鉴定不同品种种子抗性方面，萌发的相对指标如种子相对发芽势、相对发芽率、相对根长等，应用广泛，能够反映种子抗性的强弱[23-24]。因此在本研究中，认为可以用以上相对指标作为紫花苜蓿种子萌发期抗性评价指标。

综上所述，250 mmol·L-1的 NaCl和 25%PEG 能有效鉴定不同紫花苜蓿品种的抗旱耐盐性强弱，供试的14个品种中，‘法多’、‘巨能995’和‘巨能551’的抗旱耐盐性均较强。可为干旱盐碱区紫花苜蓿品种的选用提供理论依据。