CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平变化及其临床意义①

张秋叶 王极宇 张家奎 王会平 陶千山 翟志敏

(安徽医科大学第二附属医院血液科，合肥 230601)

急性淋巴细胞白血病(Acute leukemia,AL)是成人常见的急性白血病亚型之一，主要分为B-ALL和T-ALL两种。其中B-ALL最为常见，其发病率约占ALL的85%[1]。传统的治疗手段可使78%～93%的成人B-ALL患者达到完全缓解，长期无病生存占40%[2]，然而50%以上的患者会复发，而且复发之后预后极差，总生存率仅为5%～8%[3]。近年来，细胞免疫治疗取得重要进展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)治疗复发/难治性B-ALL完全缓解率高达70%～80%[4]。在CAR-T细胞治疗过程中，其最常见的不良反应为细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome,CRS)。

CRS是由CARs与肿瘤细胞表达的同源抗原结合后T细胞活化引发的[5]。活化的T细胞和免疫旁细胞释放大量的细胞因子和趋化因子[6-10]，导致血清中细胞因子水平短时间内急剧上升。轻度CRS一般给予支持治疗即可有效控制病情,但重度CRS患者若不及时处理可能会出现低血压、脏器功能衰竭等严重后果，甚至危及生命。目前明确报道与CRS严重程度有关的细胞因子有IL-6、C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)[11，12]，而其他与CRS严重程度有关的细胞因子报道并不多见。本研究通过检测和比较CD19 CAR-T 细胞输注前后血清IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α及CRP水平的变化,初步探讨其是否可作为协助诊断CRS及疾病严重程度的实验室指标，以及在预测CD19 CAR-T 细胞疗效、指导临床选择靶向细胞因子拮抗剂治疗CRS中的价值。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 回顾性分析2015年8月至2018年2月到我科接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发/难治B-ALL患者23例，诊断标准及疗效判断标准均依据《成人急性B淋巴细胞白血病诊疗指南》2015年版。所有接受CD19 CAR-T细胞治疗的患者对研究内容完全知情，并签署知情同意书，该研究获得医院学术技术委员会和大学生物医学伦理委员会审核批准。同时在美国国家临床实验中心注册备案(NCT 02735291)，接受CAR-T治疗患者的入组标准及治疗方法，安全性和疗效等已在2018第61届美国血液学年会上发表(https://ash.confex.com/ash/2018/webprogram/Paper110539.html)，具体见本课题组已发表的研究摘要[13]。

1.1.2标本采集 输注CD19 CAR-T细胞前1 d、输注CD19 CAR-T细胞结束后2 h、输注后3周内早晨空腹、发热时(T>38.5℃)、退热后第2天空腹时采集外周血3～5 ml，所有标本均采集至乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管保存，后150 r/min离心5 min取血清,置于-80℃保存。

1.1.3CRS的评价标准 CRS的诊断需满足在输注CAR-T细胞后3周内出现以下4种症状或体征中的至少1种：发热≥38℃；收缩压<90 mmHg的低血压;缺氧与动脉血氧饱和度<90%;和/或器官毒性的证据[5],将发生CRS的23例患者根据毒性程度参见国家癌症研究所不良事件常用术语标准(CTCAE v4.0.3)分为轻度CRS组(1～2级)和重度CRS组(3～5级)。

1.2方法

1.2.1CD19 CAR-T细胞的制备和回输主要分为3个步骤 ①分离PBMC。采集复发难治性B-ALL患者80～120 ml外周血分离PBMC。②将PBMC在抗CD3/CD28单克隆抗体(eBioscience，USA)和IL-2(SL Pharm，Beijing)刺激下短暂培养1～2 d，然后采用慢病毒法将CD19 CAR转染至T细胞后继续扩增培养10～12 d。③ 对CAR-T细胞进行转染率、活性度、病原体等系列检测，质量合格后转入含有人血清白蛋白的100 ml生理盐水的输液袋中，每体重组患者单个疗程回输CAR-T细胞计量为每公斤1×109～5×109个。所有CAR-T细胞均由安徽北大未名细胞治疗有限公司制备。

1.2.2微量样本多重蛋白定量技术(Cytometric bead array，CBA)法检测IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α 其中IL-6、IFN-γ检测23例，IL-10、TNF-α由于标本量少、标本丢失、检测不当等原因实际检测患者共13例，免疫比浊法检测CRP患者23例。CBA法和免疫比浊法具体步骤如下：将人细胞因子标准品,按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度稀释。捕获抗体充分振荡混匀，取1 μl/样本加入500 μl Buffer振荡后离心(200 g，5 min)弃上清，加入Bead Biluent 50 μl/样品，吹打混匀反应15 min。标记好样品的管，取50 μl/管上述步骤后再取50 μl/管血清，吹打混匀避光1 h，检测抗体充分振荡混匀，检测抗体 1 μl/样本，再取Detection Diluent 49 μl/样本避光吹打混匀，取50 μl混合好的检测抗体加入样品中(50 μl/样本)，吹打混匀避光2 h，加入1 000 μl Wash Buffer 洗液(1 000 μl/样本)，吹打混匀(200 g，5 min)离心弃上清，加入 300 μl Wash Buffer 上机检测，根据检测数据绘制标准曲线，并将标本数据与标准曲线拟合，计算出细胞因子浓度。

免疫比浊法C反应蛋白与特异抗体结合。形成不可溶的抗原抗体复合物。SYNCHRON系统按照比例自动把适量体积的样品和试剂分配到一个反应杯中。所用的样品对试剂比例为1∶26。系统将检测340 nm的光吸收变化。此光吸收变化与样品中C 反应蛋白浓度成正比。系统依此并根据一条以单点调整、预先确定的校正曲线计算并给出C 反应蛋白的浓度。

1.3统计学分析 采用SPSS16.0软件进行统计学分析，根据数据分布的正态性选择合适的统计方法，呈正态分布的数据，选择t检验，非正态分布的数据，连续性变量以四分位数进行表示，选择Wilcoxon秩和检验进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1一般临床资料 本研究共入组了23例复发/难治性B-ALL患者。其中男16例，女7例。中位年龄22岁。其中15例复发≤1次，8例复发≥2次。2例患者染色体Ph+。CD19 CAR-T细胞的回输细胞数为1.03×106个/kg至18.00×107个/kg，回输后所有患者均发生CRS，其中轻度CRS16例(1级14例、2级2例)，重度CRS 7例(3级5例、4级2例)。回输后4周后进行疗效评估，其中9例获得完全缓解(Complete remission,CR)，9例获得骨髓缓解(CR with imcomplete blood count recovery,CRi)，5例未缓解(None remission,NR)。具体见表1。

2.2CD19 CAR-T输注前后血清中细胞因子与CRP水平 为了分析CD19 CAR-T细胞治疗后患者细胞因子水平变化，我们检测了所有患者在输注CD19 CAR-T细胞前及输注后血清细胞因子水平。所有患者输注CD19 CAR-T细胞后均检测至少3次，标本采集时间点为输注CD19 CAR-T细胞结束后2 h、输注后3周内早晨空腹、发热时(T>38.5℃)、退热后第2天空腹时。然后，我们分析比较了输注后3周内细胞因子最高水平与输注前的差异。结果发现，与输注CD19 CAR-T细胞前相比，输注后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α水平显著性升高，(P=0.000，0.000，0.001，0.002)，我们同时分析了患者CRP的水平，发现输注后CRP有升高趋势但无统计学意义(P=0.055),见表2、图1、2。

表1 23例复发/难治B-ALL患者的基本临床资料

Tab.1 Basic clinical data of 23 relapsed/refractory B-ALL patients

NumberSexAge(y)CAR-Tcells/kg(×107)Number ofrelapsesTumorburden(%)CytogeneticsGenesCRSgrading4 weeks responseafter CAR-T cellinfusion1M231.6860.840 0NN1CR2M78.920.900 07,XY,+8[1]/46,XY,[15]TEL-JAK2+1CR3M225.1220.040 046,XX,i(7q)[1];46,XX[1]N1CR4M330.12520.490 0NE2A/PBX1 +1CR5M125.210.530 0[46,XX,t(9;22)](q34;q11)[12]/46,idem,del(9)(q22)[6]/46,XX[2]BCR/ABL-P1901CR6M303.0310.875 0PhBCR-ABL(P190)+1CRi7M61.1610.160 045～47,XY,add(1)(p13)∗2,del(7)(p15),t(8;14)(q24;q32),dic(9;12)(p24;q24),+12,20,inc[cp2]/46,XY[18]N1CR8F108.48 10.280 0t(16,21)(p11,q22)+N1CRi9M132.5710.450 0NN2CRi10F142.2020.030 0NN1NR11F98.5010.956 0NN2CRi12M21810.910 046,XY,t(8;14)(q24;q11)[3]/46,XY[17]MLL /MYC+1NR13F224.9320.820 0PhBCR/ABL P190(+)1CRi14F654.110.145 0NN1CRi15M344.2010.310 0NBCR-ABL-210 with T315i(E355G)1CR16M304.3840.180 0NN1NR17F353.8410.380 0NEPOR/IgH3CRi18M312.2000.720 048,XY,+8,+9[6]N3CR19M580.10310.830 0NN4NR20M193.8620.945 046,XYHOX-113CRi21M518.910.436 046,XY,[10]BCR/ABL(+),HOX(+)3CR22M403.8510.100 046,XY,12p+,+8q+,+13q+,-15,-22BCR/ABL P190(+),with T315I3CRi23F101.3500.800 054,X,+X,t(X;11)(q26;q23),+8,+8+18,+18,+21,+21[19]N4NR

Note：CR.Complete remission;CRi.Blood incomplete recovery of patients;NR.No remission.

表2 CD19 CAR-T细胞输注前后细胞因子与CRP水平[M (P25 P75)]

Tab.2 Cytokine and CRP levels before and after CD19 CAR-T cell infusion[M (P25 P75)]

IndexnBefore CD19 CAR-Tcell infusionAfter CD19 CAR-Tcell infusionPIL-6(pg/ml)2312.00(2.00-28.50)58.00(34.50-112.00)0.000CRP(mg/ml)2315.50(5.35-31.38)33.32(14.33-54.99)0.055IFN-γ(pg/ml)232.65(2.13-3.12)6.70(4.35-10.07)0.000IL-10(pg/ml)131.00(1.00-1.80)8.88(4.01-39.92)0.001TNF-α(pg/ml)134.32(2.91-4.60)17.86(4.99-40.18)0.002

图1 CD19 CAR-T细胞输注前后血清中IL-6、CRP、IFN-γ水平(n=23)Fig.1 Levels of IL-6,CRP and IFN-γ in serum before and after CD19 CAR-T cell infusion(n=23)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of CRP in serum;C.The levels of IFN-γ in serum.**.P<0.01.

2.3CD19 CRA-T细胞输注后轻度CRS、重度CRS细胞因子与CRP水平表达差异 所有患者在接受CD19 CAR-T细胞治疗后均出现了不同程度的CRS。为了分析CD19 CAR-T细胞治疗后轻度及重度CRS患者血清细胞因子表达谱，我们分析比较这些患者血清具体细胞因子表达水平差异。结果发现：输注CD19 CAR-T细胞后，重度CRS患者血清中各细胞因子水平IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α和CRP均显著高于轻度CRS组(P=0.004，0.004，0.003，0.000，0.045)，见表3、图3、4。

2.4重度CRS患者使用IL-6受体拮抗剂后IL-6水平变化 CD19 CAR-T细胞治疗后患者若出现重度CRS往往病情危重，若不及时处理死亡率极高。本研究中4例IL-6水平显著升高的重度CRS患者接受了IL-6受体拮抗剂治疗后好转。4例患者2周左右恢复正常，见图5。

2.5CD19 CAR-T细胞不同疗效间的细胞因子和CRP水平差异 CD19 CAR-T细胞治疗后4周内是否缓解分为CR/CRi组与NR组，比较CR/CRi组与NR组，两组间IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子与CRP水平，其中CR组/CRi组与NR组的IL-6、IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子与CRP水平无显著性差异，见表4。

图2 CD19 CAR-T细胞输注输前后血清中IL-10、TNF-α水平(n=13)Fig.2 Levels of IL-10 and TNF-α in serum before and after CD19 CAR-T cells infusion(n=13)Note: A.The levels of IL-10 in serum;B.The levels of TNF-α in serum.**.P<0.01.

表3 CD19 CAR-T细胞输注后轻度CRS、重度CRS细胞因子与CRP水平表达差异[M (P25 P75)]

Tab.3 Differential expression of mild CRS and severe CRS cytokines and CRP levels after CD19 CAR-T cell infusion[M (P25 P75)]

IndexMild CRS(n=16)Severe CRS(n=7)PIL-6(pg/ml)55.00(28.75-61.25)500.00(91.00-1074.00)0.004CRP(mg/ml)23.71(4.95-46.86)56.51(37.81-120.17)0.045IFN-γ(pg/ml)5.78(3.93-7.28)12.98(12.53-15.30)0.004IndexMild CRS(n=13)Severe CRS(n=5)PIL-10(pg/ml)4.69(3.13-7.47)55.65(39.92-84.97)0.003TNF-α(pg/ml)6.32(4.60-15.77)56.22(40.18-62.51)0.000

图3 CD19 CAR-T细胞输注后，轻度CRS、重度CRS血清中IL-6、CRP、IFN-γ水平(n=23)Fig.3 Levels of IL-6,CRP and IFN-γ in mild CRS and severe CRS after CD19 CAR-T cell infusion(n=23)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of CRP in serum;C.The levels of IFN-γ in serum.**.P<0.01,*.P<0.05.

图4 CD19 CAR-T细胞输注后，轻度CRS、重度CRS血清中IL-10、TNF-α水平(n=13)Fig.4 Levels of IL-10 and TNF-α in mild CRS and severe CRS after CD19 CAR-T cell infusion(n=13)Note: A.The levels of IL-6 in serum;B.The levels of TNF-α in serum.**.P<0.01.

3 讨论

据文献报道CD19 CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤CRS发生率高达100%[14]，本研究中23例患者也均发生不同程度的CRS。CRS是一种与CD19 CAR-T细胞作用机制相关的独特的靶向毒性作用[15]，其治疗主要依赖于对发生CRS患者的准确分级和在不影响CAR-T细胞疗效的情况下控制CRS症状[16]。目前对CRS的分级主要根据临床表现，缺乏实验室生物指标。由于CRS患者血清中细胞因子会在短时间内急剧上升的独特的病理生理学特点，故升高的细胞因子与CRS和CRS严重程度的关系成为现在的研究热点[17]。Dvila等[18]认为IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-10、人FMS样酪氨酸激酶3配体(Human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt-3L)、GM-CSF、分形趋化因子(Fracktalkine)这7个细胞因子水平变化与严重CRS诊断密切相关，本研究发现与CD19 CAR-T细胞输注前后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α水平显著性升高，CRP有升高趋势但无统计学意义，可能与病例数较少有关，有待于进一步收集分析。通过对轻重度CRS患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子和CRP比较发现，重度CRS患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α、CRP升高非常明显，故我们认为CRS且重度CRS可能与IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α、CRP有关。许多轻度CRS在很少干预就可缓解，然而发展到重度CRS最终可能导致短暂器官功能障碍，需要积极的干预和支持[15]，而针对重度CRS患者的治疗主要是IL-6受体阻断剂。本研究中4例IL-6显著升高的重度CRS患者，使用IL-6受体拮抗剂治疗后，患者2周左右完全恢复，故我们认为IL-6受体阻断剂治疗IL-6升高的重度CRS患者有较好的疗效。目前关于细胞因子水平与CAR-T疗效间的报道并不多见，本研究中不同CD19 CAR-T细胞疗效间IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子与CRP水平差异无统计学意义，故我们认为CD19 CAR-T细胞疗效与细胞因子与CRP水平无关。此外，CD19 CAR-T细胞输注后我们发现不同患者血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α与CRP水平在个体间差异较大，有研究报道这可能因患者肿瘤负荷及CRS严重程度存在明显差异所致，但与患者是否发热无关[18]。

图5 1～4例患者(A、B、C、D)使用IL-6受体拮抗剂后IL-6水平变化Fig.5 Changes in IL-6 levels after 1 to 4 patients (A,B,C,D)using IL-6 receptor antagonistsNote: Levels of IL-6 in A，B，C，D patients with severe CRS injection of tocilizumab.

表4 不同CD19 CAR-T疗效间细胞因子水平与CRP差异[M (P25 P75)]

Tab.4 Differences in cytokine and CRP levels between different CD19 CAR-T efficacy[M (P25 P75)]

IndexCR/CRi(n=18)NR(n=5)PIL-6(pg/ml)57.00(41.00-118.00)70.00(31.00-82.00)0.945CRP(mg/ml)40.33(12.10-76.54)23.98(18.85-33.32)0.293IFN-γ(pg/ml)6.46(4.26-9.17)9.07(5.54-10.93)0.602IndexCR/CRi(n=8)NR(n=5)PIL-10(pg/ml)15.17(4.80-34.67)8.88(4.01-39.92)0.884TNF-α(pg/ml)19.98(12.46-33.21)7.66(4.99-56.22)0.957

综上所述，CD19 CAR-T细胞治疗复发难治性B-ALL具有良好的应用前景。在治疗过程中，动态监测IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α细胞因子的水平，可作为判断CRS严重程度的实验室参考指标，并可指导临床靶向选择细胞因子拮抗剂，对防治重度CRS、确保CD19 CAR-T细胞治疗的安全性有重要价值。