芦丁对人肺癌A549/DDP细胞耐药性的逆转作用及其机制

孔祥虎 李志欣 房丽君 焦建峰

(包头市肿瘤医院，包头 014030)

肺癌是威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤之一。我国每年新增肺癌患者约733.3万例，每年死于肺癌者达610.2万例，发病率和死亡率居恶性肿瘤谱第一位[1]。由于多数肺癌患者在确诊时已为晚期，失去了手术治疗的最佳时机，放疗和化疗成为主要的治疗手段。尽管大多数肺癌患者对初始化疗敏感，但化疗耐药性的产生是其疗效下降的主要原因[2]。因此，如何逆转化疗耐药性成为肺癌治疗中亟待解决的问题之一。芦丁(Rutin,RT)，又名芸香苷，是从芸香叶中提取的一种黄酮苷类化合物。近年来研究显示，可通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，以及逆转肿瘤耐药性发挥抗肿瘤活性[3-7]。但目前国内外尚未见RT对肺癌顺铂(Cisplatin,DDP)耐药性的逆转作用的报道。本研究拟通过分子生物学方法探究RT对人肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其分子机制。本研究有望为RT治疗肺癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞A549和顺铂耐药株A549/DDP购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；RT(100 mg/支，纯度>97.1%)、IκB激酶(IκB kinase，IKK)抑制剂IKK16(10 mg/支，纯度>99%)和DDP(50 mg/支，纯度>99%)购自美国Selleck公司；胎牛血清和RPMI-1640培养液购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Trizol试剂、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；实时定量PCR反应(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物公司；兔抗人IKKα、p-IKKα(Ser176)、p65、p-p65(Ser536)、多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1,MRP1)、谷胱甘肽S转移酶-π(Glutathione S transferase-π,GST-π)、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，A549/DDP细胞用含10%胎牛血清和1 mg/L DDP的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2条件下培养；当细胞覆盖率达到80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例传代。

1.2.2CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期A549细胞和A549/DDP细胞，以每孔5 000个接种于96孔板；常规培养24 h后，实验孔分别加入100 μl含不同浓度RT和/或DDP的细胞培养液，同时设调零孔和对照孔，每组设5个复孔；培养48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度A值；计算细胞活力细胞活力=[(实验组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)]×100%；使用SPSS16.0软件的Probit回归模型计算药物的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)，并计算出耐药倍数与逆转倍数。耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50，逆转倍数=耐药细胞IC50/RT作用下IC50。实验重复3次。

1.2.3药物联合应用评价 采用Chou-Talalay中效分析法对CCK-8法检测结果进行分析；中效方程式为：Fa/Fu=(D/Dm)m，其中Fa为抑制率，Fu=1-Fa，D为药物浓度，Dm为中效浓度，m为中效曲线斜率；依据中效方程式计算不同效应的药物联合指数(Combination index，CI)，CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)，其中DX1、DX2为两药单用产生X效应时各自所需浓度，D1、D2为两药联用产生X效应时各自所需浓度；应用CompuSyn 1.0软件计算出不同Fa下的CI值，并绘制出Fa-CI曲线，若CI<1，认为两药为协同作用，CI=1为相加作用，CI>1为拮抗作用。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期A549/DDP细胞，实验分为4组：对照组、RT组、DDP组、RT+DDP组，其中RT和DDP的终浓度分别为40 μmol/L和8 μmol/L；药物作用48 h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次，先加入200 μl结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，轻轻混匀，室温避光反应15 min，用流式细胞仪分析检测。实验重复3次。

1.2.5Western blot印迹法检测蛋白水平 取对数生长期A549/DDP细胞，实验分为4组：对照组、RT组、IKK16组、RT+IKK16组，其中RT和IKK16的终浓度分别为40 μmol/L和8 μmol/L；药物作用48 h后，收集各组细胞，用RIPA裂解细胞提取总蛋白，用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，取25 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀释)，室温下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL进行发光反应，暗室X胶片显影，拍照，使用Image J1.45s软件进行灰度分析。以目标蛋白与内参β-actin的灰度比作为目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.2.6RT-PCR检测mRNA水平 细胞处理同1.2.5，收集各组细胞，用Trizol试剂提取总RNA，取2 μg总RNA进行反转录反应，反转录条件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。取2 μl上述反应液进行PCR，PCR反应条件：94℃ 1 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环。MRP1上游引物：5′-TGCTCACTTTCTGGCTGGTA-3′，下游引物：5′-TAGGGT-CGTGGATGGTTTCC-3′；GST-π上游引物：5′-CTTGGGCTCTATGGGAAGGA-3′，下游引物：5′-GACAGCAGGGTCTCAAAAGG-3′；GAPDH上游引物：5′-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3′，下游引物：5′-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3′。取5 μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，用ImageJ1.45s软件进行灰度分析，以目的产物与内参GAPDH的灰度值比值表示目的基因mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

2 结果

2.1细胞活力的变化 如图1A所示，与对照组相比，2～16 μmol/L DDP组A549细胞活力均显著下降(P<0.05)，且随着DDP剂量的增加呈下降趋势，IC50为4.95 μmol/L。如图1B所示，与对照组相比，不同剂量DDP组或RT组A549/DDP细胞活力均显著下降(P<0.05)，且随着DDP或RT剂量的增加逐渐下降，IC50分别为37.08 μmol/L和524.40 μmol/L；当两种药物按1∶10联合作用时，A549/DDP细胞活力显著低于相同浓度的DDP组(P<0.05)，药物联合的IC50为175.39 μmol/L，其中DDP和RT的浓度分别为15.94 μmol/L和159.45 μmol/L。由此可知，A549/DDP细胞对DDP的耐药倍数为7.49，而RT提高A549/DDP细胞对DDP的敏感性，逆转倍数为2.33。

2.2DDP与RT联合效应分析 采用Chou-Talalay中效分析法依据CCK-8法检测结果计算出不同Fa下的CI值，并绘制出Fa-CI曲线。如图2所示，当Fa>0.09时，CI<1，两药合用产生协同效应。这表明RT可协同增强DDP对A549/DDP细胞的抑制作用。

图1 DDP和RT对A549和A549/DDP细胞活力的影响Fig.1 Effect of DDP and RT on cell viability in A549 and A549/DDP cellsNote: A.A549 cells;B.A549/DDP cells;*.P<0.05 versus DDP 0 μmol/L group;#.P<0.05 versus DDP group at the same concentration.

图2 药物联合指数(CI)与抑制率(Fa)曲线图Fig.2 Graph of CI and fraction affected (Fa)Note: CI>1 stands for antagonistic effect;CI<1 stands for synergistic effect.

2.3DDP与RT对A549/DDP细胞凋亡的影响 如图3所示，与对照组相比，RT组细胞凋亡率的变化无统计学差异(P>0.05)，而DDP组和RT+DDP组细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)；同时，RT+DDP组细胞凋亡率显著高于DDP组(P<0.05)。

2.4RT对IKKα和p65蛋白磷酸化的影响 如图4所示，与对照组相比，RT组、IKK16组和RT+IKK16组细胞中IKKα和p65蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05)；同时，RT+IKK16组细胞中IKKα和p65蛋白磷酸化水平显著低于RT组(P<0.05)。

图3 DDP和RT对A549/DDP细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of DDP and RT on apoptosis in A549/DDP cellsNote: A.Apoptosis detection;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

图4 RT对A549/DDP细胞IKKα和p65蛋白磷酸化的影响Fig.4 Effect of RT on phosphorylation of IKKα and p65 in A549/DDP cellsNote: A.Western blot assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

图5 RT对A549/DDP细胞MRP1和GST-π蛋白表达的影响Fig.5 Effect of RT on protein levels of MRP1 and GST-π in A549/DDP cellsNote: A.Western blot assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

图6 RT对A549/DDP细胞MRP1和GST-π的mRNA表达水平的影响Fig.6 Effect of RT on mRNA levels of MRP1 and GST-π in A549/DDP cellsNote: A.RT-PCR assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

2.5RT对MRP1和GST-π蛋白表达的影响 如图5所示，与对照组相比，RT组、IKK16组和RT+IKK16组细胞中MRP1和GST-π蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；同时，RT+IKK16组细胞中MRP1和GST-π蛋白表达水平显著低于RT组(P<0.05)。

2.6RT对MRP1和GST-π的mRNA表达水平的影响 如图6所示，与对照组相比，RT组、IKK16组和RT+IKK16组细胞中MRP1和GST-π的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；同时，RT+IKK16组细胞中MRP1和GST-π的mRNA表达水平显著低于RT组(P<0.05)。

3 讨论

RT是广泛存在于多种植物包括芸香、番茄、荞麦、烟草和连翘等的一种黄酮醇配糖体，具有抗炎、抗病毒、抗氧化和降血压等药理作用[8-10]。近年来，RT的抗肿瘤作用逐渐受到关注。Nafees等[3]研究证实，RT可通过下调Bcl-2/Bax蛋白比值以及激活p38信号通路诱导结肠癌HT-29细胞凋亡。Elsayed等[5]研究表明，RT通过下调c-Met蛋白磷酸化水平抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭。RT还可通过抑制P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达逆转乳腺癌MCF-7/耐阿霉素(Adriamycin，ADR)细胞耐药性[11]。本研究显示，RT可与DDP协同抑制A549/DDP细胞活力，并增强DDP诱导的A549/DDP细胞凋亡，这表明RT可逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

肿瘤细胞内药物积累量的减少是耐药性产生的重要原因之一，而化疗药物外排主要由ATP 结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体介导。DDP在细胞质中水解后容易与胞内含硫分子结合形成复合物，该复合物可由MRP1(即ABCC1)泵出肿瘤细胞，导致DDP耐药性的产生[12]。Lan等[13]研究证实，外源性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)可通过抑制MRP1和GST-π表达提高肺癌A549细胞对DDP的敏感性。Fang等[14]研究显示，抑制STAT3活化可下调MRP1和P-gp表达以逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。本研究显示，RT和IKK16均可下调MRP1的mRNA和蛋白表达水平，且两者联用时抑制作用增强。上述研究表明，MRP1表达量升高与肺癌细胞DDP耐药性的产生关系密切，而RT可通过抑制IKKα/p65信号通路下调MRP1表达。

GST-π可催化GSH与DDP的结合反应，这使得DDP无法进入细胞核与靶点DNA结合，从而产生DDP耐药性[15]。Zhao等[16]研究显示，上调GST-π表达可降低宫颈癌SiHa细胞对DDP的敏感性。Lin等[17]研究证实，敲除GST-π可抑制肺癌A549/DDP细胞增殖和迁移，并逆转其DDP耐药性。本研究显示，RT和IKK16均可抑制GST-π蛋白和mRNA的表达，且两者联用时抑制作用更强。这表明，RT可通过抑制IKKα/p65信号通路下调GST-π表达，由此逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

由p50和p65形成的异型二聚体是哺乳动物细胞中最常见的NF-κB蛋白。在细胞质中，NF-κB通常与IκB结合而以无活性状态存在。活化的IKKα可磷酸化IκB导致其降解，同时磷酸化p65促进其进入细胞核，进而调控靶基因的表达[18]。Ma等[19]研究显示，抑制NF-κB信号通路可下调MRP1和P-gp蛋白表达，从而增强人T淋巴瘤Jurkat和HuT-78细胞对DDP的敏感性。敲除p65会导致乳腺癌阿霉素(Doxorubicin,Dox)耐药株MCF-7/Dox细胞中MDR1和P-gp蛋白表达水平降低[20]。Zhou等[21]研究证实，抑制NF-κB信号通路可通过下调MRP1和GST-π蛋白表达逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。本研究表明，抑制IKKα/p65信号通路可在转录水平抑制A549/DDP细胞中MRP1和GST-π表达。

综上所述，RT可在体外增强DDP对人肺癌A549/DDP细胞的毒性作用，这可能与其抑制IKKα和p65蛋白磷酸化，进而下调MRP1和GST-π的mRNA和蛋白表达水平有关。