IFN-γ对犬BMSCs增殖及分泌多种免疫抑制因子的影响①

李丹婷 黄晓雅 白利鹏 沈留红 曹随忠 余树民

(四川农业大学动物医学院，成都 611130)

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是来自于具有异质性的非造血部分的骨髓细胞群体，占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%[1]。BMSCs具有高度增殖、自我更新及多向分化潜能，在一定条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多类细胞[1]。BMSCs不仅可以参与组织修复，而且可以减轻同种异体环境中的免疫排斥反应，许多动物和临床研究均证实BMSCs在心血管病、移植物抗宿主病(Graft versus-host disease，GVHD)以及自身免疫性疾病方面的治疗潜力[2]。BMSCs通过与多种免疫细胞的相互作用调节免疫功能，主要以促进调节性T细胞的生成为主，其诱导机制尚不完全清楚[3]，但已证实BMSCs可以通过与淋巴细胞直接接触和分泌多种可溶性因子来发挥作用[4]，而激活其表面受体TLRs已经被研究作为一种可能的手段来提高BMSCs的效力[5]。

近年来，BMSCs的免疫抑制特性调控炎症发生与转归备受关注。IFN-γ和TNF-α是在多种损伤和病理情况下介导炎症事件的重要促炎细胞因子。在体内炎症或移植病例中，BMSCs受这些因子的刺激，也引起BMSCs免疫调节活性的变化，据报道IFN-γ通过上调抑制性分子B7-H1来增强BMSCs的免疫抑制行为[6]，但是IFN-γ影响BMSCs作用机制和相关途径尚不清楚。为进一步探讨IFN-γ对BMSCs免疫调节功能的调节，本研究以犬BMSCs为材料，研究IFN-γ对BMSCs增殖、免疫抑制因子表达和分泌可溶性因子能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试动物 6月龄左右健康中华田园犬6只，购于四川省雅安市。

1.1.2主要试剂与仪器 LG-DMEM干粉培养基(Gibco公司)；FBS(HYclone公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；CD34、CD105、CD90抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、胰岛素、IBMX、吲哚美辛，茜素红、油红O(Sigma分装)；RT-qPCR试剂盒(TaKaRa公司)；CCK-8检测试剂盒(东仁化学科技有限公司)；ELISA试剂盒(上海圆创生物科技有限公司)；超净工作台(苏州净化设备集团有限公司)；二氧化碳培养箱、酶标仪、激光共聚焦显微镜(Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；实时荧光定量 PCR 仪(CFX96TM，Bio-Rad 公司)。

1.2方法

1.2.1犬BMSCs的制备 取6月龄犬全身麻醉后，做无菌股骨穿刺，用肝素抗凝，抽取一定量骨髓液。用PBS充分洗涤2次，离心后弃上清液。将细胞沉淀直接用细胞培养液(LG-DMEM，15%FBS，1%青链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)悬浮细胞，计数后按108～109个/ml的密度接种于细胞培养皿中。放置在37℃、5% CO2的培养箱内培养3～5 d。待出现贴壁细胞集落后首次全量换液，换液后每3 d换一次培养液。待10～14 d细胞长至80%融合度后用含0.25%胰酶-0.02%EDTA PBS溶液消化细胞并传代培养，传至第3代，用于后续实验。

1.2.2犬BMSCs的免疫荧光检测鉴定 取3代(P3)的细胞，按5×103个/孔接种在24孔板，细胞达到 60%～80%汇合时按抗体说明进行CD34、CD90、CD105的免疫荧光检测：贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，每次3 min，经4%的多聚甲醛溶液室温固定细胞30 min，PBS洗涤3次，加正常羊血清室温封闭30 min，吸出血清，分别加入CD90(1∶50)、CD105(1∶50)、CD34(1∶100)，阴性对照以PBS当作一抗。37℃过夜孵育，加入荧光二抗-FITC(1∶500)湿盒中20～37℃孵育1 h，在荧光显微镜下观察，

1.2.3犬BMSCs体外向骨细胞、脂肪细胞诱导分化鉴定 取生长良好的P4细胞，用胰酶消化后，以3×104个/ml密度接种于24孔培养板中，待细胞长至60%～70%融合时分别换成成骨诱导液(10 nmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，10%FBS，LG-DMEM)和成脂诱导液(1 μmol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素，0.1 mmol/L IBMX，200 μmol/L 吲哚美辛，10%FBS，LG-DMEM)进行分化诱导，每3 d换液一次。成骨分化诱导第21天用茜素红进行成骨细胞染色，镜下观察红染的钙结节并拍照记录。成脂分化诱导14 d用油红O进行脂肪细胞染色，镜下观察细胞质内红色的油滴并拍照记录。

1.2.4CCK-8 法测定IFN-γ 刺激犬BMSCs后的增殖潜能 取P4细胞按4×103个/孔种入96孔板，贴壁后更换含有IFN-γ终浓度为10、20、50、100 ng/ml的细胞培养液，以未刺激的同批次同代数的BMSCs作为对照。利用CCK-8试剂盒于IFN-γ刺激72 h后酶标仪测量在450 nm处的吸光度值(A450 nm)。细胞增殖率与吸光度值呈正比。

1.2.5RT-qPCR 检测IFN-γ预处理后的BMSCs中免疫调节相关基因的表达 分别用含有IFN-γ终浓度为10、20、50、100 ng/ml的细胞培养液处理处于对数生长期的BMSCs 72 h 后收集细胞，并以未刺激的同批次同代数的BMSCs 作为对照。用Trizol法细胞总RNA，按反转录试剂盒说明操作合成 cDNA。再利用 SYBR-green 法定量PCR 反应试剂盒配制定量 PCR 反应体系，于实时荧光定量 PCR 仪上，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase，GAPDH) 基因为内参基因，测定 BMSCs细胞内吲哚胺 2-3 双加氧酶 1(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO1)、IDO2、环氧合酶2(Cycloo-xygenase 2，COX2)、Toll样受体3(TLR3)、TLR4等免疫抑制基因的表达情况，引物序列见表1。以未激活的BMSCs为对照组，目的基因的表达量通过2-ΔΔCT与内参基因对比(ΔΔCt=CT 目的基因/CT内参基因) ，对照组各基因表达量设为1。

1.2.6ELISA检验IFN-γ预处理后的BMSCs中因子分泌情况 在6 cm2培养皿中加入含IFN-γ终浓度为10、20、50、100 ng/ml的细胞培养液激活培养BMSCs。72 h后更换无血清培养液培养1～2 d。取该条件培养液用0.22 mm滤膜过滤后用ELISA试剂盒测定犬尿氨酸、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、IL-10、TGF-β1、HGF的含量。以未激活的BMSCs细胞条件培养液作为对照组。

2 结果

2.1犬BMSCs的免疫荧光鉴定 原代培养的间充质干细胞中可见有细胞集落形成，细胞分布不均匀，杂细胞较多；传代培养后呈均一的梭形贴壁生长，核质比较大，平行状或旋涡状紧密排列，可见分裂相(图1A、B) 。细胞免疫荧光检测P3-P5细胞抗原>CD105和CD90，高强度荧光表达，均呈阳性；CD34，荧光弱强度荧光表达，呈阴性(图2)。

表1 GAPDH,IDO1、IDO2、TLR3、TLR4、COX2的引物序列

Tab.1 Primers of GAPDH, IDO1, IDO2,TLR3,TLR4,COX2

Gene IDPrimer sequence(5′-3′)Productlength (bp)GAPDHF:TCCCGCCAACATCAAA163R:TCACGCCCATCACAAACIDO1F:AGTCCGGGAGTTTGTTCGTTC298R:AAAATGTGCCCTTGTTTGAGTTACIDO2F:TGGCTTTATACTGGTGACTGTTTTG249R:GGCATTGCTGGGTTATCCTTTLR3F:TCTACCTTTCCTACAACAAATACCTACA211R:TTCTCAAGACCCTCCAACAGCTLR4F:GGGACAACCAGACTGAAGCATT166R:GGTAACGGAGGTTTCTGAGGGCOX2F:CCCATACAAGCACAATAGACGC102R:AAAGGATTCGGAGGGAAGGTA

图1 犬骨髓间充质干细胞培养特征(×100)Fig.1 Characteristics of canine bone marrow mesen-chymal stem cell culture(×100)Note: A.Primary (P0) cells；B.Third generation (P3) cells.

2.2犬BMSCs体外定向诱导分化鉴定

2.2.1生长良好的P4细胞换成脂诱导液诱导分化培养过程中，细胞内出现折光性强的空泡物质，诱导分化14 d后，通过油红O染色可见细胞出现染成橘红色的脂肪颗粒(图3A)，提示BMSCs可分化为脂肪细胞。

2.2.2生长良好的P4细胞换成骨诱导液诱导分化培养过程中，细胞变不规则样，培养 21 d 后，细胞堆积成钙化结节，通过茜素红染色染成红色(图3B)，提示BMSCs可分化为成骨细胞。

2.3IFN-γ对犬BMSCs增殖潜能的影响 实验结果如图4所示，与对照组相比，添加梯度浓度的IFN-γ对BMSCs有增殖作用，且随浓度的增加，增殖作用越强，但用100 ng/ml浓度的IFN-γ处理后，对BMSCs的增殖作用反而下降。

图2 犬骨髓间充质干细胞表面抗原免疫荧光检测(×200)Fig.2 Immunofluorescence detection of surface antigen of canine mesenchymal stem cells(×200)Note: A.Cell expression of CD105 in cells；B.Cells expressed CD90；C.Cells do not express CD34；D.Negative control.

图3 诱导分化细胞染色后镜检(×100)Fig.3 Microscopic examination of induced differentiated cells after staining(×100)Note: A.Cells after adipogenic differentiation induced by oil red O staining;B.Cells after osteogenic differentiation induced by alizarin red staining.

2.4用IFN-γ处理对BMSCs表达免疫调节相关基因与相关因子生成的影响

2.4.1实时定量PCR检测IFN-γ预刺激后BMSCs表达Toll样受体(TLR)mRNA的情况 实时定量 PCR 结果显示，未处理的 BMSCs不表达或低表达TLR3和TLR4 mRNA。IFN-γ处理后，BMSCs中 TLR3 mRNA 表达明显升高，且具有剂量依赖性，用终浓度为50 ng/ml IFN-γ处理BMSCs，TLR3的表达最高(图5A)；TLR4 mRNA 表达无明显变化(图5B)。

2.4.2IFN-γ促进BMSCs中 IDO mRNA表达和犬尿氨酸的分泌 实时定量 PCR 结果显示，未处理的 BMSCs低表达IDO1和IDO2 mRNA。IFN-γ处理后，BMSCs 中 IDO1 mRNA 表达明显升高，且具有剂量依赖性，用终浓度为IFN-γ 50 ng/ml处理BMSCs，IDO1的表达最高(图6A)；IDO2 mRNA表达无明显变化(图6B)。

图4 CCK-8法检测犬BMSCs的增殖 Fig.4 CCK-8 method to detect proliferation of BMSCs in canineNote: Compared with the control group，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

图5 不同浓度IFN-γ处理BMSCs TLR3、TLR4 mRNA表达的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of BMSCs TLR3 and TLR4 mRNA expressions treated by IFN-γ inoculation at different concentrationsNote: *.P<0.05 vs 20 ng/ml group；**.P<0.01 vs control group.

ELISA检测结果显示，IFN-γ刺激后，BMSCs分泌的犬尿氨酸升高，有剂量依赖性(表2)。

2.4.3IFN-γ 抑制BMSCs的 COX2 mRNA表达和PGE-2的分泌 实时定量 PCR 结果显示，IFN-γ处理后，BMSCs 中 COX2 mRNA 表达明显降低，用终浓度为100 ng/ml IFN-γ处理BMSCs时，COX2 mRNA的表达量最低 ，与对照组相比差异极显著(图7)。

图6 不同浓度IFN-γ处理BMSCs IDO1、IDO2 mRNA表达的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of BMSCs IDO1 and IDO2 mRNA expressions treated with IFN-γ inoculation at different concentrationsNote: **.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs 20 ng/ml group.

IFN-γ(ng/ml)Kynurenine(ng/L)0434.5±6.50010473.0±5.0001)20512.5±3.5001)50583.0±5.0001)100611.0±4.0001)

Note：1)P<0.01 vs control group.

图7 不同浓度IFN-γ处理BMSCs COX2 mRNA表达的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of BMSCs COX2 mRNA expression treated with IFN-γ at different concentrationsNote: *.P<0.05 vs control group；**.P<0.01 vs control group.

IFN-γ(ng/ml)PGE2(ng/L)0505.8±3.88510604.8±4.5352)20479.3±3.2401)50439.8±2.5902)100405.5±5.8252)

Note：1)P<0.05 vs 0 ng/ml group；2)P<0.01 vs 0 ng/ml group.

图8 不同浓度IFN-γ对BMSCs分泌HGF、IL-10、TGF-β含量的影响Fig.8 Effects of IFN-γ in different concentration on BMSCs secretion of HGF,IL-10 and TGF-βNote: *.P<0.05 vs 0 ng/ml group；**.P<0.01 vs 0 ng/ml group.

ELISA检测结果显示，IFN-γ刺激后，10 ng/ml剂量组，BMSCs分泌的PGE2增加，其余组PGE2的分泌都受到显著的抑制，且有剂量依赖性，差异具有统计学意义(表3)。

2.5用IFN-γ处理对BMSCs分泌IL-10、HGF、TGF-β含量的影响 ELISA检测结果显示，IFN-γ刺激后，除了10 ng/ml剂量组外，其余组BMSCs分泌的HGF显著增加，且有剂量依赖性，差异具有统计学意义(图8A)；除了100 ng/ml剂量组外，其余组BMSCs分泌的IL-10显著增加，20 ng/ml剂量组极显著地促进了IL-10的分泌(图8B)；除了20 ng/ml 剂量组外，50 ng/ml剂量组显著抑制了TGF-β的分泌，10 ng/ml和100 ng/ml剂量组极显著地抑制了TGF-β的分泌(图8C)。

3 讨论

本研究中，我们成功从正常犬骨髓中分离获得BMSCs，并通过诱导多向分化，反映出该细胞具有较强的分化潜能。虽然骨髓间充质干细胞的潜在分化能力提高了人们对BMSCs的兴趣，但另一方面它们的免疫支持能力也受到了临床治疗研究的关注。有研究表明IFN-γ对人和小鼠的BMSCs功能有显著影响，IFN-γ刺激后，可以改变间充质干细胞与增殖能力相关的miRNA表达水平，进而影响间充质干细胞的增殖能力[7]。本研究验证了IFN-γ的添加，促进了BMSCs的增殖潜能，并且具有浓度依赖性。但高浓度的IFN-γ刺激反而会降低BMSCs的数量。

通过前期文献查阅，IFN-γ可以与细胞表面的TLR等受体结合调节免疫调节作用[8]。而TLR主要在抗原呈递细胞上表达，并识别保守的病原体衍生成分。TLR的连接激活多种先天和适应性免疫应答途径，以消除和保护入侵病原体。BMSCs表面TLR被激活后(主要是TLR3、TLR4)，可以特异性增强对Treg的诱导，提高细胞免疫抑制功能[9,10]，本实验结果证明IFN-γ刺激BMSCs后主要是通过上调细胞表面TLR3的表达而非TLR4，从而发挥作用。参考前期文献资料显示，经TLR启动的BMSCs能分别极化为不同表型的BMSCs1和BMSCs2，观察后发现由TLR4启动的BMSCs——BMSCs1有促炎调节作用，而由TLR3启动的BMSCs——BMSCs2表现更多的是免疫抑制[11]。由本结果推测IFN-γ的刺激可能激活TLR3信号通路。

与此同时，TLR介导的免疫抑制作用依赖于色氨酸降解酶IDO产生的免疫抑制性犬尿氨酸。而IDO分为IDO-1和IDO-2两个亚型，其中IDO-1 具有负向调控免疫应答的能力，能够预防急性移植排斥反应[12]。本研究结果验证，IFN-γ的刺激可能主要增强了IDO-1的表达而促进了BMSCs的免疫抑制作用能力，并具明显的剂量依赖性，而IDO-2在这个过程中起的作用较小。 经ELISA检测BMSCs分泌的犬尿氨酸的表达量也随IFN-γ出现显著地增加，继而可能影响T细胞的增殖或促使初始T细胞向调节性T细胞分化[13]，负调控免疫应答。

BMSCs 介导的免疫调节作用也是多种可溶性因子参与的结果，已有报道的可溶性因子包括TGF-β、HGF、IL-2和 IL-10、一氧化氮(Nitric oxide，NO)以及PGE2[14-16]。在本研究中，IFN-γ处理后的BMSCs所分泌的HGF和IL-10都有一定程度的增加。其中，IL-10 是 Treg 细胞发挥其免疫抑制功能的关键性细胞因子，Treg 通过分泌 IL-10 抑制 Th1 介导的免疫反应、Th2介导的抗体产生和 CD8+细胞毒性T细胞的活化[17]；HGF则主要是诱导细胞周期蛋白D2的减少和增加p27kip1在T细胞中表达，最终导致G1细胞增殖停滞阶段从而T细胞的增殖得到抑制[18]。说明本试验用IFN-γ处理BMSCs后一定程度上提高了其分泌抑炎因子的能力。而 TGF家族分子是多效性细胞因子，在癌症、免疫调节和伤口愈合中具有重要作用。在之前的研究中TGF-β也发挥抗炎作用，抑制T细胞增殖。但在Xu等[14]的研究中发现，与其已确立的免疫抑制作用相反，BMSCs和活化T细胞共培养体系中，TGF-β逆转了BMSCs对T细胞增殖的抑制作用。在本实验中，BMSCs分泌这种因子，但在刺激下，TGF-β的分泌出现较明显的下降，其对于免疫抑制的作用还有待进一步的研究。

另外比较有趣的发现是，PGE2是重要的细胞生长和炎症介质，是COX-2的代谢产物，拥有免疫调节功能。有研究证明BMSCs中PGE2的分泌有时间依赖性，在培养4～5 d后下降，在MLR早期(48 h)PGE2起到抑制作用[19]。在本研究中显示，在IFN-γ刺激下，PGE2的分泌量是在作用72 h时间点所测的，COX-2的表达量呈现明显的降低且PGE2的分泌量在大剂量作用下分泌降低，其中作用机制还需进一步研究。

综上所述，IFN-γ对BMSCs的增殖能力有一定促进作用，并且能够诱导BMSCs免疫抑制因子表达，提高分泌可溶性因子能力。本试验证明IFN-γ主要通过激活TLR3胞内通路作为BMSCs有效的刺激因子，在一定程度上有促进BMSCs免疫抑制能力的潜力。同时也通过刺激后提高体外培养BMSCs的免疫调节能力对于提高细胞治疗效力、减少不良反应、降低治疗成本等临床应用具有重要意义。本研究希望为BMSCs应用于临床辅助治疗避免免疫紊乱做有益的探索。