凋亡相关蛋白在阿尔茨海默病病理改变中的作用

温世荣 于艳红 王德生 王春利 李绪领 杨 慧

1.哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，黑龙江哈尔滨 150001；2.山东省立第三医院神经内科，山东济南 250031；3.哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，黑龙江哈尔滨 150001

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是以进行性记忆力损害和认知功能障碍为特征。异常磷酸化tau（p-tau）蛋白破坏微管稳定性及轴浆运输，致神经元凋亡，形成神经元纤维缠结（NFT），而tau 蛋白聚集而成的双螺旋（PHFs）是AD 的病理基础之一[1-3]；B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）有抗凋亡作用。但AD 的p-tau 蛋白与Bcl-2 途径的关系尚无明确结论。本研究旨在利用P8 品系快速老化小鼠（SAMP8）[4-5]评价药物抑制Bcl-2 后小鼠的空间记忆能力，比较Bcl-2、p-tau 蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等水平的变化，解析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3 月龄SAMP8 小鼠6 只、6 月龄SAMP8 小鼠12 只、6 月龄抗快速老化系1（SAMR1）小鼠6 只均由天津中医药大学附属第一医院提供（合格证书编号：0004580）。小鼠均为健康雄性清洁级小鼠，无特定病原体级动物环境饲养。本研究经哈尔滨医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准（伦理编号：2016011）。

1.2 主要仪器与试剂

小鼠Morris 水迷宫仪（黑龙江省中医药大学）；自动数据采集及处理系统（黑龙江省中医药大学）；尼康50i 研究型正置显微镜；NIS-Elements F3.21 图像采集软件（Nikon Inc.Japan）；图像分析软件（imagepro-plus 6.0，Media Cybernetics，Silver Spring，Maryland，USA）。Obatoclax mesylate（GX15-070，武汉博士德生物工程有限公司，BA3971）；Rabbit Anti-Caspase-3（P11）；Rabbit Anti-BCL-2；p-tau 蛋白（sc-101813）；兔二抗等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 小鼠适应性饲养1 周后随机分组。A 组为6 月龄SAMR1 小鼠6 只、B 组为3 月龄SAMP8 小鼠6 只，均作为对照组；C 组为6 月龄SAMP8 小鼠6 只（假治疗组）；O 组为6 月龄SAMP8 小鼠6 只（药物组）。O 组腹腔注射Obatoclax 0.2 mL，C 组注射等量生理盐水，连续干预14 d。

1.3.2 水迷宫实验 实验训练阶段连续进行6 d。将定向航行小鼠面向池壁随机取东、西、南、北4 个起始位置之一，记录小鼠找到水下平台所需的时间（s）即潜伏期。第1、2 天训练（可视平台），第3～5 天定向航行（隐蔽平台），第6 天空间探索（去平台）。实验过程使用图像采集分析系统记录游泳轨迹。空间搜索动物由原象限对侧入水，记录进入目标象限次数。

1.3.3 药物干预及二次水迷宫实验 初次水迷宫后，C 组腹腔注射0.9%生理盐水0.2 mL/只；O 组腹腔注射等量的Obatoclax 3 mg/（kg·d）；每日1 次，连续2 周。A 组和B 组不做干预。按初次方法重复水迷宫实验并采集数据。

1.3.4 灌注取脑及切片 二次水迷宫后的小鼠开胸经左心室插管至升主动脉，快速灌注生理盐水60～100 mL、随后灌注4%多聚甲醛100～150 mL，取脑组织，固定，脱水，连续冠状切片，厚度为3 μm。

1.3.5 免疫组化染色 石蜡切片，脱蜡，脱水，修复，兔血清封闭。一抗Bcl-2（1∶200）、Caspase-3（1∶100）、p-tau蛋白（1∶80）4℃过夜。兔二抗IgG 室温孵育20 min。二氨基联苯胺法染色，苏木精复染，脱水，透明，封片。

1.3.6 结果判读 每个标本取5 张切片，高倍镜（400×）下观察海马区不重叠的5 个视野并拍照，记录阳性细胞（棕黄色）数。图像分析系统测定积分光密度（IOD值），IOD 值=area×平均光密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验

A、B、C 三组两次水迷宫的潜伏期和穿过平台次数比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。在第二次水迷宫实验中，O 组的潜伏期明显延长，穿过平台次数显著减少，且O 组潜伏期明显长于B 组及C 组，B、C组长于A 组，B 组长于C 组；O 组穿越平台次数少于B组及C 组，B、C 组少于A 组，C 组少于B 组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组动物水迷宫结果比较（±s）

表1 各组动物水迷宫结果比较（±s）

注：与本组第一次比较，*P ＜0.05；与A 组同期比较，△P ＜0.05；与B 组同期比较，◇P ＜0.05；与C 组同期比较，#P ＜0.05

2.2 免疫组化染色结果

2.2.1 Bcl-2 与A 组比较，C 组表达Bcl-2 的IOD 值和阳性细胞计数差异无统计学意义（P ＞0.05）；与C 组比较，O 组表达Bcl-2 的阳性细胞计数显著增加（P ＜0.05）。见图1、表2。

2.2.2 Caspase-3与A组比较，C组和O组表达Caspase-3 的IOD 值显著增加（P ＜0.05）；O 组表达Caspase-3 的IOD 值与C 组比较，各组阳性细胞计数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2、表3。

图1 各组小鼠海马区表达Bcl-2 的阳性细胞情况

表2 A 组、C 组与O 组Bcl-2 的IOD 值和阳性细胞计数比较（±s）

表2 A 组、C 组与O 组Bcl-2 的IOD 值和阳性细胞计数比较（±s）

注：与C 组比较，*P ＜0.05。Bcl-2：B 细胞淋巴瘤/白血病-2

图2 各组小鼠海马区表达Caspase-3 的阳性细胞情况

表3 A 组、C 组和O 组Caspase-3 的IOD 值和阳性细胞计数比较（±s）

表3 A 组、C 组和O 组Caspase-3 的IOD 值和阳性细胞计数比较（±s）

注：与A 组比较，*P ＜0.05。Caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3

2.2.3 p-tau 蛋白 与A 组比较，C 组和O 组p-tau蛋白的IOD 值显著增加（P ＜0.05）；O 组p-tau 蛋白的IOD 值与C 组比较，各组阳性细胞计数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

表4 A 组、C 组和O 组p-tau 蛋白IOD 和阳性细胞计数比较（±s）

表4 A 组、C 组和O 组p-tau 蛋白IOD 和阳性细胞计数比较（±s）

注：与A 组比较，*P ＜0.05

3 讨论

AD 以进行性认知功能损害为特征，发病率随年龄增长而增加，是严重的医学和社会问题。SAMP8 小鼠和SAMR1 小鼠由日本京都大学竹田俊男培育，SAMP8小鼠的脑部病理及学习记忆功能衰退与AD 类似。本研究中水迷宫实验结果亦验证了SAMP8 小鼠增龄性空间记忆功能减退的特性。

细胞凋亡在AD 神经元特别是海马区[6-7]丢失中扮演重要角色。Bcl-2 家族蛋白与凋亡关系密切，Bcl-2为抗凋亡亚家族代表，属于细胞内膜蛋白，与家族内促凋亡蛋白Bax 或者Bax/Bak 聚合体结合，可抑制凋亡级联反应。神经元Bcl-2 减少可致损伤敏感[8-9]。SAMP8 小鼠腹腔注射Bcl-2 拮抗剂Obatoclax 后学习记忆能力进一步减退，一方面提示Bcl-2 抑制剂具有加速老化作用，同时也提醒临床医生在应用该类药物抗肿瘤等治疗时应注意可能存在认知方面的副作用[10]。

Obatoclax 通过抑制Bcl-2 发挥促凋亡作用，而本研究结果却与预期结果不一致，可能与效应蛋白化学结构有关。Bcl-2 家族成员含有BH1、BH2、BH3、BH4 4 个功能域，Obatoclax 是拟BH3 结构，与Bcl-2 结合，使Bcl-2 的BH3 结合活性丧失，而抑制抗凋亡功能。也有研究显示，Obatoclax 促进仅含BH3 结构域的促凋亡蛋白Noxa 与抗凋亡蛋白Bcl-2 结合，使促凋亡蛋白Bax 或Bax/Bax 聚合体释放，或直接激活Bax/Bax聚合体促进细胞凋亡[11-13]。因此，本研究推测Obatoclax 可能促使Bcl-2 与Bax 或Bax/Bak 解聚，导致Bcl-2 一过性增多。将在下一步实验中验证Obatoclax应用后Bcl-2 表达是否有时效性。

Caspase 是细胞凋亡的重要执行者[14-15]。Caspase分为凋亡启动因子（Caspase-9、Caspase-8、Caspase-10）及凋亡效应器（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）。Caspase-3 是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，研究认为Bcl-2 不仅作用在Caspase-3 上游，而且也是Caspase-3 的直接底物，二者在神经元凋亡中起着关键性作用[16-18]。微管是神经细胞中参与胞体与轴突营养输送通道，tau 蛋白有促进微管装配及稳定微管的作用[19]，p-tau 蛋白形成PHFs 是AD 神经元退化的基础。Bcl-2 可抑制Caspase-9、Caspase-3 的活性，阻止tau蛋白聚集成PHFs 减缓AD 进展，或直接稳定微管、保护神经元骨架的稳定性[15-16，20]。Yeh 等[21]发现p-tau 蛋白过度表达的细胞Bcl-2 失活形式增多，可抑制Bcl-2抗凋亡作用。这些研究提示Bcl-2 与p-tau 蛋白和Caspase 之间存在复杂联系。

本实验中O 组与C 组比较，p-tau 蛋白和Caspase-3 的阳性细胞表达虽有增多趋势但差异无统计学意义。这可能与实验动物样本量偏小有关，可以通过增大样本量进一步验证；另一方面也可能是因为Bcl-2 位于p-tau 蛋白和Caspase-3 的下游，或是通过独立于二者的路径发挥作用。本实验中Caspase-3 和p-tau 蛋白的表达呈相同趋势，符合以往研究所显示的tau 蛋白是Caspase-3 的底物，经Caspase-3 裂解生成p-tau 蛋白。

综上所述，本实验显示在认知变化过程中Bcl-2是一个关键成分，记忆力减退可能不是通过Caspase-3和p-tau蛋白途径发挥作用。