玉米ZmLBD7基因的序列变异分析

滕青 尹双义

摘 要：LBD基因编码植物一类特有的转录因子，在植物生长发育中具有至关重要的作用。为分析特异在玉米穗部表达的ZmLBD7基因的核苷酸多样性，基于目标序列定点捕获对280个玉米自交系中的ZmLBD7位点进行了重测序。结果发现该基因在供试群体中有52个变异位点，其中32个为SNP，20个属于indel变异。由于该基因在演化过程中缺少遗传重组，该基因表现出偏离中性进化的特征，并且其编码区的5个变异仅等导致2种单倍型，编码2种蛋白质。

关键词：玉米;ZmLBD7基因;序列变异;遗传重组

LBD基因家族编码植物特有的一类转录因子，其蛋白序列中包含保守LOB结构域（Lateral organ boundaries domain）。[1]该基因家族成员最初是通过增强子陷阱的方法，在拟南芥中鉴别出一个在侧生器官基部特异表达的基因，并将其命名为LOB基因。[2]根据编码蛋白质序列的氨基酸组成特征，拟南芥中的LBD基因可以分为两种类型，其中I类LBD基因编码蛋白质序列中的典型特征是具有一个非常保守的CX2CX6CX3C锌指类结构域和一个LX6LX3LX6L结构域，而II类LBD基因编码的蛋白质序列中只具有保守的锌指类结构域。[3]基于对拟南芥、水稻、毛果杨、番茄和紫花苜蓿等模式植物基因组的分析，发现LBD基因属于多基因家族，在多数植物基因组中通常含有20-60个左右的LBD基因[1，4]。在多个植物物种中对LBD基因的功能进行了阐释，发现该基因家族主要参与高等植物侧生器官的形态建成，特别是在侧生器官与顶端分生组织之间边界的形态建成起到关键作用[5];除此之外，一些LBD基因还参与氮素的吸收同化等植物的次级代谢。[6]

玉米（Zea mays L.）是我国第一大粮食作物，也是全世界重要的粮食作物之一。已有研究表明，玉米的LBD基因在其生长发育中具有重要的作用。玉米的RTCS基因属于LBD基因家族，其具有典型的转录因子特征，其突变体rtcs植株仅有一条初生根，缺失种子根和节根。[7]玉米的IG1基因也属于LBD基因家族，通过突变体分析发现该基因能够调控玉米叶片形态和胚囊发育。[8]全基因组分析发现玉米基因组中至少具有44个LBD基因，[9]其中基于玉米的转录组分析发现ZmLBD7基因（GRMZM2G076327）特异的在穗部表达，[10]表明其可能与穗部性状发育有关。该基因位于玉米的1号染色体，编码的蛋白质序列中具有LOB结构域。因而，在自然群体中分析ZmLBD7基因的序列变异，并阐明其与穗部性状的关联，将为玉米穗部性状的遗传改良提供重要的借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为来自于我国玉米常用自交系和来自于国外的核心玉米种质，共计280份玉米自交系。

1.2 DNA提取和ZmLBD7基因测序

供试玉米种质在实验室中采用水培方式种质，在出苗15d后剪取顶端嫩叶，并采用改良的CTAB法提取基因组DNA。DNA浓度利用分光光度计检测，并采用琼脂糖凝胶电泳方法检测提取的DNA质量。以玉米自交系B73的ZmLBD7基因序列为捕获模板，采用NimbleGen平台在供试玉米材料中对为该基因位点进行目标序列定点捕获，并进行目标片段重测序。基因组序列的目标序列定点捕获和重测序均由华大公司完成。

1.3 数据分析

通过Clustal X软件[11]对玉米ZmLBD7基因的全长序列进行比对，比对后的结果用于进行序列分析。采用DNAsp软件[12]进行序列变异参数的计算：包括核苷酸多样性参数π和θ，中性进化参数Tajima's D[13]、Fu与Li的D*和F*[14]，和连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）特征值r2。LD随距离的衰减曲线参照Remington等[15]定义的非线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 玉米ZmLBD7基因的序列变异

以玉米自交系B73的ZmLBD7基因（GRMZM2G076327）的全长序列作为模板，在280个自交系种质中定点捕获了该位点的序列。经多序列比对，共得到2458bp的ZmLBD7基因全长序列，其中启动子区段1158bp，第一外显子区段366bp，内含子区段89bp，第二外显子区段378bp，3端序列438bp。进一步分析发现，该基因位点中共包含52个变异，涵盖115个核苷酸位点（表1）。其中31个属于SNP变异位点，平均每79.3bp有1个SNP;共有21个indel变异，平均每117.0bp有1个indel。根据该基因的注释信息，其包含2个外显子区段和1个内含子区段。内含子区具有较高的变异频率，平均每17.8bp便有1个变异（包括SNP和indel）。在第一个外显子区域发现了2个SNP和1个indel，而在第二个外显子区域仅发现了2个SNP，未發现indel。

核苷酸多态性通常用参数π和θ作为衡量的指标，其中π是衡量同一位点不同序列两两之间差异的参数;而θ则是衡量群体突变率的参数指标，与核苷酸变异占序列位点数的比率有关。ZmLBD7基因全长序列（含启动子区）的π值为0.0051，θ值为0.0021（表2）。在中性进化的条件下，核苷酸多样性的两个参数π和θ的值应该近似相等。而Tajima's D测验可以通过比较群体突变率的2个估计值π和θ的差异来检验选择效应。利用玉米ZmLBD7基因序列中的多态性位点进行了中性进化检测，结果发现ZmLBD7位点的Tajima's D值均为正值，且均达到了显著水平。此外，全长序列的Fu与Li的D*和F*的测验值分别为2.0405和3.4103，均达到了显著水平。这些结果表明该基因位点存在大量的中等频率的等位变异，可能是由于群体瓶颈效应或对该基因位点平衡选择的结果。

2.2 ZmLBD7基因的单倍型分析

根据所测玉米ZmLBD7基因的核苷酸变异信息，可以将280份玉米自交系划分成7个单倍型，分别命名为H01-H07（表2）。单倍型H01所包含的自交系数目最多，为96个，占供试材料的34.29%。除H06之外，其余的单倍型均包含2个及以上的自交系。ZmLBD7基因的编码区具有4个SNP变异位点和1个indel变异位点，这些核苷酸位点的多态性可以将供试材料划分成2种单倍型，分别命名为HC01和HC02。其中181个自交系属于HC02，占所有供试材料的64.6%。

2.3 ZmLBD7基因的连锁不平衡和遗传重组

对最低等位基因频率在0.05以上的变异位点进行了连锁不平衡分析，并以位点距离和连锁不平衡参数r2构建了散点图，结果发现在ZmLBD7位点连锁不平衡衰退非常慢，在该基因区段没有衰减至0.1以下（图2）。进一步对玉米ZmLBD7基因位点的所有多态性位点估算了最小遗传重组数，但并未检测到明显的遗传重组，这可能是导致连锁不平衡衰减缓慢的主要原因。

3 小结与讨论

自然群体中丰富的核苷酸变异是作物遗传改良的基础，因而分析功能基因的遗传变异不仅能揭示目的基因的遗传演化规律，还将为基因的功能鉴定提供重要的借鉴。核苷酸变异包括SNP和indel两种形式，其中SNP是在基因组中发生频率高、数量多、密度大。[16，17]本研究中发现ZmLBD7位点也具有丰富的变异，在280个玉米自交系中共发现了52个变异，但是大部分变异分布在上游的启动子区域。此外，内含子区域具有较多的变异，平均每17.8个碱基存在一个变异。通常情况下，由于外显子区段受到较多的选择压力，往往会导致较少遗传变异的产生。本研究中也发现玉米ZmLBD7基因在外显子区段的变异要远低于启动子区段和内含子区段，仅仅有5个变异。

本研究还发现玉米ZmLBD7基因不仅连锁不平衡衰退的较慢，还偏离了中性进化。其中性进化参数Tajimas D、Fu and Li's D*和F*均为正值，表明在该基因位点上存在大量的中等频率的突变，根据中性进化学说可能是由于群体瓶颈效应，群体结构，或者平衡选择引起的。因本自然群体来源较为丰富，而且也具有丰富的变异，因而可能是由于对该基因的平衡选择导致了其偏離中性进化。进一步分析发现该基因尽管存在了一些变异，但是没有检测到遗传重组，说明对该基因的平衡选择导致了其连锁不平衡衰退的较慢，进而导致了其偏离了中性进化。

参考文献：

[1]Yang Y，Yu X，Wu P.Comparison and evolution analysis of two rice subspecies LATERAL ORGAN BOUNDARIES domain gene family and their evolutionary characterization from Arabidopsis[J].Molecular Phylogenetics & Evolution，2006，39（1）：248-262.

[2]Majer C，Hochholdinger F.Defining the boundaries：structure and function of LOB domain proteins[J].Trends in Plant Science，2011，16（1）：47-52.

[3]Matsumura Y，Iwakawa H，Machida Y，et al.Characterization of genes in the ASYMMETRIC LEAVES2/LATER ORGAN BOUNDARIES（AS2/LOB）family in Arabidopsis thaliana，and functional and molecular comparisons between AS2 and other family members[J].Plant Journal，2009，58（3）：525-537.

[4]Bin S，Reynagapena Cristina G，Springer P S.The lateral organ boundaries gene defines a novel，plant-specific gene family[J].Plant Physiology，2002，129（2）：747-761.

[5]Hongjia L，Shoufeng W，Xiaobo Y，et al.ARL1，a LOB-domain protein required for adventitious root formation in rice[J].Plant Journal，2010，43（1）：47-56.

[6]Grit R，Takayuki T，Fumio M，et al.Members of the LBD family of transcription factors repress anthocyanin synthesis and affect additional nitrogen responses in Arabidopsis[J].Plant Cell，2009，21（11）：3567-3584.

[7]Changzheng X，Huanhuan T，Muhammad S，et al.Cooperative action of the paralogous maize lateral organ boundaries（LOB）domain proteins RTCS and RTCL in shoot-borne root formation[J].New Phytologist，2015，207（4）：1123-1133.

[8]Evans M M S.The indeterminate gametophyte1 Gene of Maize Encodes a LOB Domain Protein Required for Embryo Sac and Leaf Development[J].The Plant Cell，2007，19（1）：46-62.

[9]Schnable P S，Doreen W，Fulton R S，et al.The B73 maize genome：complexity，diversity，and dynamics[J].Science，2015.

[10]Jiang，Biao，Zeng，et al.Genome-wide Transcription Factor Gene Prediction and their Expressional Tissue-Specificities in Maize[J].Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（9）：616-630.

[11]Thompson J D，Gibson T J，Higgins D G.Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX[J].Curr Protoc Bioinformatics，2002，Chapter 2（Unit 2）：Unit 2.3.

[12]Julio Rozas A F-M，Juan Carlos Sánchez-Delbarrio，Sara Guirao-Rico，Pablo Librado，Sebastián E Ramos-Onsins，Alejandro Sánchez-Gracia DnaSP 6：DNA Sequence Polymorphism Analysis of Large Datasets[J].Molecular Biology & Evolution，2017，34（12）.

[13]Tajima F，.Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J].Genetics，1989，123（3）：585-595.

[14]Fu Y X，Li W H.Statistical tests of neutrality of mutations[J].Genetics，1993，133（3）：693-709.

[15]Remington D L，Thornsberry J M，Matsuoka Y，.，et al.Structure of linkage disequilibrium and phenotypic associations in the maize genome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（20）：11479-11484.

[16]楊泽峰，张恩盈，蒋莹，等.玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析.玉米科学，2014，22（5）：20-28.

[17]徐暑晖，杨泽峰.玉米ZmSSIV基因的序列变异及其对淀粉理化特性的影响.扬州大学学报（农业与生命科学版），2015，36（3）：54-61.