猪流行性腹泻病毒流行毒株HNLB的分离鉴定

蔡芳玲 焦国莲 杨进才

摘 要 本研究将采集自河南某猪场的疑似感染PEDV的猪肠道及其内容物处理后接种于Vero细胞并进行连续体外传代培养。经过S基因遗传进化分析、RT-PCR和间接免疫荧光试验等成功在体外分离鉴定了该毒株，并命名为PEDV HNLB。该毒株能够在Vero细胞上稳定传代并产生典型的细胞病变效应（CPEs），其第6代的病毒滴度达到104.3TCID50/mL。HNLB毒株的成功分离为今后研制新型、有效的PEDV疫苗奠定了基础。

关键词 猪流行性腹泻病毒；毒株分离鉴定；疫苗

Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus HNLB Strain

Abstract： In this study， the pig intestinal tract and its contents collected from a suspected PEDV infected in a pig farm in Henan were treated and inoculated into Vero cells and subjected to continuous in vitro subculture. The strain was successfully isolated and identified in vitro by S gene genetic evolution analysis， RT-PCR and indirect immunofluorescence assay， and named as PEDV HNLB. The strain was able to stably pass on Vero cells and produce typical cytopathic effects （CPEs） with a 6th generation virus titer of 104.3 TCID50/mL. The successful isolation of the HNLB strain laid the foundation for the development of a new and effective PEDV vaccine in the future.

Key words： Porcine epidemic diarrhea virus； Isolation and Identification； Vaccine

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐、脱水、厌食和极度消瘦为主要特征的高度接触性肠道传染病[1， 2]。所有日龄的猪均易感染，且不同日龄的猪感染后临床症状有明显差别，成年猪出现轻微腹泻症状，死亡率较低，而新生仔猪感染后症状较为严重，其感染率和死亡率高达80%-100%[3]。PED给我国养猪业带来了巨大的经济损失，成为目前亟待解决的一大难题。

PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒属成员，病毒粒子形态呈球形，有囊膜似皇冠状[4]。病毒核酸为不分节段的、线性、单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约为28-30 Kb[5]，由5′非编码区（UTR）、七个开放阅读框（ORFs）和3′非编码区（UTR）组成。病毒基因组结构为5′-复制酶（1a/1b）-S-ORF3-E-M-N-3′。5′端有帽子结构，3′端有polyA尾巴结构。七个ORFs编码三种非结构蛋白，即ORF1a、ORF1b和ORF3，以及四种结构蛋白，分别为纤突糖蛋白（S）、小分子膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。

PED于1971年首次在英国被报导，但并未从感染猪只中分离出猪流行性腹泻病毒[2]。1978年，比利时暴发PED疫情并从发病猪肠道内容物中分离出了PEDV CV777毒株[6]。1973年我国首次报道了PED疫情，随后证实其病原为PEDV。宣华等首次用猪胚胎肠单层细胞成功培养PEDV并通过荧光抗体染色试验和中和试验证实[7]。此后，PED在我国以零星小规模发生为特征。2010年10月，一种不同于欧洲经典毒株CV777的高致病性变异毒株在我国流行，导致PED在全国范围内显著增加并迅速蔓延，引起有史以来最严重的PED疫情。随后，在亚洲、欧洲、美洲等大部分国家和地区也都暴发了由高致病性变异毒株引起的较大规模的PED疫情。近年来，我国当前PED疫情较为严重，阳性率居高不下，给养猪业的疾病防控带来了严峻的挑战。本研究从河南灵宝采集到病料中分离到了PEDV毒株并对其遗传性状、免疫原性和生物学特性进行研究，以期为PEDV的致病机理研究和疫苗研制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 病料和细胞

病料样本采集自2017年河南灵宝某猪场疑似腹泻仔猪的肠道及内容物。Vero细胞由实验室冷冻保存。

1.1.2 主要试剂

PrimeSTAR？ GXL DNA Polymerase和DNA ladder Marker购自宝生物工程（大连）有限公司； DMEM（1×）、Anti-Anti（100×）、PBS（1×）、胎牛血清（FBS）、0.25% Trypsin-EDTA（1×）购自Gibco公司。QIAquick？ Gel Extraction Kit和RNeasy？ Mini Kit提取试剂盒来自Qiagen公司； solution（TPB）购自Sigma；AMV反转录试剂盒购自Promega公司（美国）；PEDV抗N蛋白單克隆抗体由清弘生物科技有限公司制备。

1.2 方法

1.2.1 病料檢测及处理

将采集到的疑似腹泻的猪肠道及内容物用本用本实验室建立的RT-PCR方法检测表明PEDV阳性。将肠内容物用DMEM维持培养基稀释，涡旋并4 ℃、3，500 rpm离心30 min。吸取处理好的样品上清液并用0.22 μm孔径的过滤器过滤，作为病毒原料储存在-70 ℃。

1.2.2 病毒的分离及传代培养

将Vero细胞接种在T-25培养瓶中并置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，形成100%铺满的单层Vero细胞后弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞三次，将制备好的1mL病毒原液接种到含20 μg/mL胰蛋白酶的上述细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中孵育1 h，然后加入DMEM生长培养基后继续培养，每天观察细胞病变效应（CPEs）。当超过90%的细胞显示出CPE时，收集上清液和细胞，冻融三次，一部分储存于-80℃冰箱中备用，一部分用同样的方法继续传代培养。

1.2.3 PCR引物设计 参考GenBank中已经提交的PEDV CV777毒株的N基因和S基因序列（AF353511），使用Primer 5.0软件进行引物设计，设计的引物由生物公司进行合成（表1）。

1.2.4 RT-PCR鉴定

取病变细胞处理后的上清液，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，以此RNA为模板进行RT-PCR反应。反应体系（25 μL）：5×AMV RT buffer 5 μL，10 mM dNTP 3μL，下游引物2 μL，AMV反转录酶0.5μL，RNA抑制剂RRI 0.5 μL，RNA模板1μL ，DEPC H2O 13 μL。反转录程序：42℃ 1 h。以反转录获得的cDNA为模板，利用PrimeSTAR？ GXL DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增反应。反应体系（50 μL）：5×PrimerStar GXL buffer 10 μL，dNTP 4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，cDNA 3 μL，DEPC H2O 28 μL。反应程序：98 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，68 ℃ 1 min，34个循环；68 ℃ 1 min，4 ℃保存。将PCR产物在0.8%-1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，采用QIAquick？ Gel Extraction Kit对目的片段进行纯化。将目的片段测序后与PEDV CV777进行序列比对。

1.2.5 免疫荧光（IFA）

将HNLB毒株第6代（P6）病毒以MOI=0.01接种到6孔板中的Vero细胞上。在接种6，12，24 h后，弃去培养基并用PBS洗涤细胞3次。将细胞用4%多聚甲醛在4 ℃下固定30 min，然后加入1 mL渗透剂（0.25%Triton X-100），室温下静置10 min。用PBS洗涤三次，然后加入5%牛血清白蛋白BSA；封闭细胞1 h。每孔加入1∶2，000稀释的小鼠抗PEDV-N蛋白MAbs抗体，37 °C下反应1 h。然后加入1∶1，000稀释AlexaFluor？488荧光素标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37 °C孵育1 h。最后，将细胞用DAPI染色5 min并用PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察成像。

1.2.6 S基因序列测定及遗传进化分析

使用RNeasy Mini Kit从病毒细胞培养液中提取病毒RNA。PEDV S基因扩增引物参考Table1。通过RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，然后用DNA凝胶试剂盒纯化。将靶片段克隆到PCR-XL-2TOPOTM载体中，并通过限制酶切割和测序确认阳性质粒。测序后分别通过DNAStar和BioEdit分析软件对S基因进行序列分析。

1.2.7病毒粒子的电镜观察

PEDV感染Vero细胞后，当产生的CPE大于90%时收取病毒液。收集上清液和细胞，冻融三次，10，000 rpm离心1 h，用 0.22 μm孔径的过滤器过滤以除去细胞碎片。随后，向上清液中加入聚乙二醇8000（PEG-8000），使其终浓度达到10%。在4 ℃、12，000 rpm下离心2 h，将病毒颗粒重悬于tris缓冲液（TBS）中，然后用2%的磷钨酸负染，透射电子显微镜（JEOL，JEM-1200EX，Japan）观察，并对感染到Vero细胞表面上的病毒粒子进行成像。

2 结果

2.1 毒株的分离与鉴定

2.1.1 病料样品的RT-PCR检测

利用表1中的特异性引物，对HNLB毒株P0进行N基因扩增。得到1323 bp大小的特异性片段（图1），与目的片段大小一致，测序比对该序列为PEDV N基因序列。

2.1.2 PEDV毒株的分离

将疑似PEDV感染的仔猪肠道内容物处理后用基于N基因引物进行PCR鉴定并将阳性样品接种于Vero细胞，连续体外传代培养。我们在连续传代培养的细胞中观察到典型的细胞病变效应，具体表现在细胞变圆，合胞体，液泡和最终脱落。将P6病毒以MOI为0.01接种到铺满单层Vero细胞的六孔板中，接种后在显微镜下观察不同时间段的CPEs（图2 A-C）。（A）在显微镜（200×）下观察接种后6h的CPE。（B-C）病毒感染后24h和36h分别观察到CPEs。

2.1.3 PEDV分离毒株的IFA鉴定

将分离的HNLB毒株P6以MOI=0.01接種到铺满Vero细胞的六孔板中，用PEDV-N特异性单克隆抗体鉴定。IFA结果表明：接种6 h、12 h、24 h、后均能观察到绿色荧光信号，且荧光信号逐渐增强（图3AC）。（A）荧光显微镜（400×）下观察PEDV HNLB P6感染Vero细胞后6 h的免疫荧光结果。分别用小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体（MCAbs）和4，6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）检测PEDV抗原和细胞核；（B，C）感染后12和24 HPI中观察到绿色荧光信号。

2. 1.4 PEDV分离毒株S基因遗传进化分析

S基因的序列分析显示：与经典PEDV毒株CV777相比PEDV HNLB毒株存在着典型的插入和缺失，这一特征与目前在中国和其他国家分离到的高变异PEDV毒株相似。基于S基因的系统进化树分析表明PEDV HNLB毒株属于GIIb基因型（图4）。

2. 1.5 PEDV分离毒株的病毒粒子电镜观察

通过电子显微镜（EM）对PEDV HNLB毒株的病毒粒子进行成像，能够观察到典型的冠状病毒颗粒，直径约80-120 nm，呈皇冠状（图5）。

3 讨论

PED于1971年首次在英国报道，1986年传播到中国[8]。从1986年到2010年，类似于经典毒株CV777的PEDV毒株在我国广泛流行，并对我国养猪业造成了一定的经济损失[9]。这段时期基于经典CV777毒株的灭活或减毒疫苗被广泛研发，对我国PED疫情的预防和控制发挥了重要作用[10]。王明等于1993年制备了世界上第一个PEDV组织灭活苗[11]。1994-1995年马思奇等人以CV777毒株和TGEV弱毒株为抗原制备了PEDV细胞灭活疫苗和TGE-PED二联灭活疫苗[12， 13]。1999年佟有恩等用PEDV CV777和TEGV克隆化弱毒株制成了TGE-PED二联弱毒疫苗[14]。2003-2006年之间，TGEPED二价弱毒和灭活疫苗在中国猪群中得到了广泛的应用。

2010年以后，不同于经典毒株CV777的PEDV高致病性变异毒株在我国广泛暴发，引起仔猪高发病率和死亡率，对养殖业造成了严重经济损失[9]。研究表明高致病性的PEDV变异毒株目前已经在中国、美国及其他国家暴发并成为当前全球的主要流行株。经过S基因进化树分析，这些变异的PEDV毒株与传统毒株不同，属于GII型毒株。该类毒株为高变异强毒力毒株，以S基因存在插入、缺失和突变等为典型特征。基于CV777毒株的传统疫苗不能提供有效的保护，而针对变异毒株的新型疫苗的研发成为当前PED疫情防控的关键因素。

2015年，我国研究人员为了更好地应对高致病性变异毒株带来的PED疫情，开发了基于PEDV GI-b毒株ZJ08和GII-b毒株AJ1102的二价减毒疫苗（PEDV和TGEV），同时也制备了基于GII-b型PEDV毒株的二价灭活疫苗[15]。但随着PEDV变异毒株S基因的不断变化，我们需要研究更多不同基因型毒株的生物学特性，再能应对当前逐渐呈现广泛流行的PED疫情。同时研究发现，高致病性的变异毒株能够提高仔猪对同源病毒的挑战[16]，这表明开发高致病变异毒株的新型疫苗成为当前最迫切的要求。为此，我们在Vero细胞上成功分离并传代了PEDV HNLB毒株，同时对其遗传性状及生物学特性进行了研究，S基因遗传进化分析表明该毒株属于GIIb型毒株，这为了解我国PEDV毒株流行状况及为目前开发新疫苗提供了思路。

4 结论

本研究中成功在Vero细胞上分离并连续培养了PEDV毒株HNLB并进一步阐明了该毒株的遗传变异性状及生物学特性。本研究提供的信息对于未来我国仔猪抗PEDV病毒研究和开发针对PEDV的新型有效疫苗有重要作用。

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