金银花细胞悬浮培养体系的建立研究

祖恩凡 赵晨晨 张凌霄 钱晶晶

摘要：以金银花脱毒苗为试材，研究了外植体、培养基对金银花疏松愈伤组织的诱导以及悬浮培养液中激素种类及其浓度和初始接种量对金银花悬浮细胞生长的影响。结果表明：幼叶最易诱导愈伤组织;细胞悬浮培养最佳培养液为：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 m01L;最佳初始接种量为60g/L。

关键词：金银花;疏松愈伤组织;细胞悬浮培养

金银花（Lonicera japonica）为忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物，有研究指出，金银花含有大量化学成分，如挥发油中多有不饱和烯萜类和芳香醇类物质、有机酸类、黄酮类和皂苷等。金银花含有大量的化学成分，具有清热解毒、疏散风热的功能，用于治疗温病发热、风热感冒、咽喉肿痛、肺炎、丹毒、蜂窝状组织炎和痢疾等多种疾病，为临床最常用中药之一。金银花作为食品、饮品应用广泛，且市场前景广阔。近年来，大部分提取物都是采用金银花植物提取，若采用人工栽培方式培育，生长周期相对较长;而植物组织或细胞培养具有不受环境和季节影响、培养周期短等优点。

1材料与方法

1.1试验材料

外植体来源于安徽科技学院种植基地，采集健壮的无病虫害金银花的新生嫩茎，去除叶片作为外植体，用流水冲洗10min后备用。

1.2试验方法

1.2.1外植体消毒。放入外植体，用无菌水冲洗3～4次。将外植体放入超净工作台中，用无菌水冲洗3次，分别用双氧水中浸泡消毒7min，再用无菌水冲洗5次，最后将冲洗好的材料放于滤纸上备用。

1.2.2愈伤组织诱导。将茎切成小段，处理叶片时则在叶脉处轻轻划上3～4道伤口，而后将截面朝向培养基，固体培养基均为：MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.2mg/L。l周后，比较不同外植体诱导形成的愈伤组织性状及生长状况。试验中不同外植体接种为一组试验，每组做3个重复，取平均数绘制生长曲线。

1.2.3誘导率与褐化率的统计。诱导率（%）=形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体块数×100;褐化率（%）=褐化愈伤组织块数/愈伤组织总数×100。

1.2.4细胞悬浮培养。继代2次后，选择生长旺盛、结构疏松的愈伤组织块，用镊子夹碎或用小刀分割得到愈伤组织碎块，转移到装有MS液体培养基的三角瓶中进行悬浮培养，置于摇床内110r/min，26～C振荡培养，每7d继代1次，继代时培养物用200目的灭菌细胞筛过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。试验过程中采用不同激素（6 BA、NAA和2，4-D）及不同浓度的组合（表2）比较不同激素及浓度处理对金银花悬浮细胞生长的影响。建立金银花细胞悬浮体系最优培养体系。试验中不同激素组合为一组试验，每组做3个重复，取平均数绘制生长曲线。

1.2.5接种量对金银花悬浮细胞生长的影响。选取起始接种量4，6，8g，L，研究不同接种量对金银花悬浮细胞生长的影响。每3d观察生长情况，并分别取得细胞称鲜重。试验中每个接种量为一组实验，每组做3个重复，取平均数绘制生长曲线。

2结果与分析

2.1外植体对愈伤组织诱导的影响

表1数据中显示，幼叶诱导形成的愈伤组织较为疏松，生长较快，褐化率较低;老叶诱导形成的愈伤组织也较为疏松，褐化率低，但生长缓慢;而嫩茎诱导形成的愈伤组织较为坚硬，褐化率高。因此该试验选择金银花的幼叶作为外植体。

2.2激素对金银花细胞培养诱导的影响

由表2可知，不同的激素种类和不同浓度配比对金银花愈伤组织的诱导有明显的影响。6-BA含量越高诱导的细胞悬浮液颜色越绿，且分散性不好，不适合细胞悬浮培养。而2，4-D含量较高的组合中诱导的培养液颜色为黄色，分散性较好。

试验显示，MS+6-BA 0.6 mg，L+NAA 0.5 mg/L+0.2 mg，L是金银花细胞悬浮适合的激素组合。

2.3金银花细胞悬浮培养

金银花细胞悬浮培养采用的液体培养基激素配比与诱导愈伤的固体培养基相同。结果发现，细胞生长经历了4个阶段：迟滞期、快速生长期、平衡期和衰亡期，表现为典型的S形生长曲线。液体悬浮培养条件下，细胞的生长周期为15d（图1）。

2.4初始接种量对金银花悬浮细胞生长的影响

初始接种量对金银花细胞悬浮培养的影响，初始接种量按每瓶（25mL培养液）接种鲜重1、1.5、2g的愈伤组织，接种于液体培养基中，使细胞培养液浓度为40、60、80g/L。

图1显示，接种量较低时细胞的生长较为缓慢，接种量高时细胞出现了褐化死亡，培养液变为褐色。而接种量为低处理组的生长期最长，细胞生长量最大。

初始接种量对细胞的增殖有明显的影响，初始接种量达到一定的值后细胞才能增殖，这是由于植物细胞的群集效应而引起的;另一方面，接种量过高则细胞密度大，导致培养液中的养分很快被耗尽，同时容易积累有害物质，最终导致细胞衰老，细胞的生长量随即逐渐减少。该研究结果表明，60g/L为金银花细胞悬浮培养最适初始接种量。

3结论与讨论

金银花为我国传统中药材，其历史悠久。目前，对于金银花无性繁殖的文章中涉及组织培养的研究较多，未查阅到金银花细胞悬浮培养的相关文献。本试验采用MS基础培养基，通过外植体选择、激素选择和起始接种量的研究初步建立起了金银花细胞悬浮体系。试验中，最适外植体为金银花幼叶;最适悬浮培液为：MS+6-BA 0.6 mg/+NAA 0.5 mg/L+0.2mg/L，最佳起始接种量为60gL。

通过本次试验建立起金银花细胞悬浮培养体系并为今后的金银花细胞产物提取打下基础。