OPG/RANKL/RANK信号通路在骨质疏松症中的研究 进展

李佳 栾志伟 黄星 姚军

骨质疏松症（ osteoporosis，0P） 是多种病因引起的一组骨病，以单位体积内骨组织量减少为特点的一种全身性的骨代谢疾病。在多数0P中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致，以骨骼疼痛、易于骨折为特征。在老年人群中更为多见，是导致老年人致残的主要原因之一[1]。我国人群40岁以上骨质疏松患病率约20%。我国60-69岁的老年女性的0P发生率高达50%-70%，老年男性为30%[2]。OP并发症致残率高，最严重的并发症是骨质疏松性骨折，以髋部骨折最为严重，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担。

目前0P的病因及发病机制并不完全清楚，正常成人的骨骼中成骨细胞与破骨细胞处于一种动态平衡，使骨组织不断更新，以维持骨骼的强度和弹性，骨保护蛋白（OPG），核因子-κB （NF-κB） 配体激活受体（RANKL）、肿瘤坏死因子家族新成员（RANK）参与并调节骨的动态平衡，这一动态平衡被破坏后导致骨的丢失引起骨质疏松[3]。随着骨细胞分子生物學研究的进展，发现OPG/RANKL/RANK信号通路是调控破骨细胞及骨质疏松症的重要途径，在破骨细胞的形成和抑制中起着重要的调控作用。许多激素、细胞因子、生长因子通过作用于该信号通路影响骨代谢而导致0P。因此，对OPG/RANKL/RANK信号通路的深入研究，可为0P提供潜在的治疗新途径。

1、成骨细胞与破骨细胞

1.1成骨细胞（osteoblast OB）OB来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，是唯一负责骨形成的细胞类型，主要功能是分泌骨基质并调节其钙化，最终形成大量骨盐沉积。OB通过Wnt信号/β-catenin信号通路调节骨形成，此外OB在骨吸收中也扮演着重要的角色。OB产生的M-CSF，RANKL和OPG在破骨细胞形成和功能中起着必不可少的作用。

1.2 破骨细胞（osteoclast OC）OC是一种巨大的多核细胞，在骨髓基质细胞分泌的多种因子作用下由单核细胞前体融合而成。由骨重建单元（BRUs）内或其

周围的细胞分泌的巨噬细胞克隆刺激因子（M-CSF）、核因子-κB （NF-κB） 配体激活受体（RANKL）等细胞因子的作用下刺激分化产生[4]。研究发现RANKL的增高与OC的激活存在一定的相关性，RANKL与OC及其前体细胞表面上的RANK结合后，能促进OC的分化、增殖、多核化以及增强骨吸收[5]。

1.3成骨细胞与破骨细胞的相互调节作用 OB不仅与骨形成密切相关，而且在骨吸收过程中也起着关键性作用。体外实验发现，OB是调控骨吸收的中心细胞，大部分骨吸收因子的受体只存在于OB而非OC上，OB接受骨吸收因子的刺激后分泌RANKL，在M-CSF存在的前提下，RANKL与M-CSF结合到OC的前体细胞表面受体RANK和M-CSFR上，RANK胞内区的特异性位点与OC内的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（TRAFs）结合，即TRAF-6，引起OC下游信号的链式反应[6]。而OB分泌的OPG则以二聚体的形式竞争性地与三聚体RANKL结合，阻断RANK与RANKL的结合，从而抑制OC的形成和成熟过程。骨髓基质干细胞向OB分化的过程中，OPG与RANKL的比值处于动态变化之中，随着OB与基质细胞的分化成熟，RANKL/OPG的比值缩小，最后将失去对OC的分化和成熟过程的调控，从而使骨形成与骨吸收达到动态平衡。故OB通过OPG/RANKL/RANK信号系统调节着对OC分化活化与凋亡的关系。

2、OPG/RANKL/RANK信号通路概述

2.1骨保护素（OPG）OPG是1997年Simonet等[7]在测序胎鼠小肠cDNA文库时发现的段序列，因其所表达的蛋白具有骨保护的作用而命名。OPG是OB和骨髓间充质干细胞分泌的一种分泌型糖蛋白。OPG的蛋白有7个结构域，形成3个功能区：①肿瘤坏死因子受体包括1-4结构域，形成OPG的主要结构域，执行抑制OC的功能。②同源区5-6属于死亡域，与Fas蛋白跨膜区形成融合蛋白，具有很强的细胞毒性，可以引起细胞的凋亡。③肝素结合属于第7结构域，其作用尚未明确[8]。

2.2 RANKL RANKL是于1998年Lacey等用OPG做探针时发现的OB或基质细胞表面表达的OPG配体蛋白，人RANKL基因位于染色体13q14，其分子由317个氨基酸组成，分为3种亚型，跨膜蛋白RANKL1、RANKL2以及分泌型RANKL3，以RANKL1存在最为广泛[9]。RANKL由OB、T细胞和内皮细胞表达，是OC形成的关键因子。近几年有文章描述RANKL的逆向信号现象，逆信号现象即跨膜的信号蛋白不仅可以向它的受体传递信号，还可以作为“反受体”接受信号，将细胞外的信息转导如宿主细胞内。有证据表明表达RANKL的T细胞可接受来自重组RANK蛋白或重组OPG蛋白的逆向信号，从而促进T细胞凋亡。对同样表达RANKL的OB，RANK是否可以通过RANKL发送逆向信号从而影响OB的功能状态尚未有研究证实 [10]。另外RANKL在OB高尔基体中大量储存，OPG则可使RANKL保持在胞内，减少其释放至胞膜及胞外[11]。

2.3 RANK  RANK于1997年Anderson等在直接测定人骨髓衍生树突状细胞cDNA时发现的。RANK在骨骼肌、小梁骨、肝脏、小肠以及肾上腺均有表达。RANK由616个氨基酸组成，可与TRAF1，2，3，5，6结合。RANK在体内主要存在于可溶型和跨膜蛋白型两种方式：前者在血液中存在，可发挥阻断RANKL促进OC分化生长的功能; 后者存在于OC表面，选择性地与RANKL结合，促使骨吸收[12]。RANK与RANKL结合后被激活，通过TRAFs启动胞质内的信号级联反应，RANK有3个结合位点与TRAF2，5，6结合，其中最重要的是TRAF转接RANK的刺激并传导给下游的NF-κB、JNK和Src通路，从而促进OC的分化、成熟及阻止OC凋亡。

3、OPG/RANKL/RANK信号通路的信号转导

3.1 OPG/RANKL/RANK信号系统通过激活一系列的信号级联反应，启动和调控基因的转录来调节OC的分化、活化和凋亡。RANKL可以提高NF-κB和c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）的活性。因此NF-κB、蛋白激酶C途径、JNK与OPG/RANKL/RANK信号系统的激活有关[13]。RANK在细胞内的特殊位点与TRAF的结合是所有信号传导中最为关键的一步。RANK信号转导途径的激活使TRAF6蛋白积聚，IKK激活，IκB被磷酸化降解，激活 NF-κB，并进入细胞核执行核内转录过程，增加AP-1家族中的c-Fos的表达，c-Fos进一步与活化的T细胞核因子结合并相互作用，启动OC生成基因的转录。一般情况下RANKL可以激活肿瘤坏死因子受体相关因子6（ TRAF6），后者进一步激活NF-κB和c-Jun氨基末端激酶（ JNK） 通路，同时促使C-Fos表达，故TRAF6和C-Fos是OC形成所必需的。此外，RANKL与RANK的结合激活了内在的信号传导级链，膜结合型RANKL或可溶性的RANKL结合并活化受体RANK，RANK刺激通过转接分子（诸如TRAF和Gab 2） 诱导的NF-κB、MAPK和磷脂酰肌醇途径以控制OC生成。破骨细胞最终形成的标志性事件是NFATc1的激活，NFATc1的表达依赖于TRAF6-NF-κB及c-Fos通路。激活的NF-κB可移至细胞核内与NFATc1的启动子结合，并且RANKL刺激后几分钟内NFATc2亦结合于NFATc1的启动子上，NFATc2与NF-κB共同激活NFATc1的启动子，上调NFATc1的早期表达，并且在RANKL诱导下，TRAF6募集于RANK的胞质端，进而动员细胞内的钙信号激活钙神经素，活化的钙神经素去磷酸化并激活NFATc1，随后NFATc1转移至细胞核内，在其启动子上与c-Fos、c-Jun形成三元络合物，进而刺激NFATc1的自身放大表达 [14]。研究发现miRNA能通过调节不同的细胞因子从而影响OC的分化，例如TRAF6是miR -125a的靶基因，而NFATc1作为TRAF6的下游靶点，能够通过结合miR -125a的启动子来调节其表达，因此，miR -125a与TRAF6和NFATc1构成了一个负反馈调节通路来调节OC的分化和成熟[15]。

4、OPG/RANKL/RANK信号通路的表达调控

4.1 激素 许多激素通过作用于OPG/RANKL/RANK信号通路影响骨代谢。雌激素是参与骨代谢的一种非常重要的激素，雌激素不仅可以促进OPG的分泌，也可以直接抑制RANKL受体激活和M-CSF介导的骨髓单核祖细胞分化为OC。研究发现雄激素可以通过调节成骨细胞OPG系统相关基因的表达影响OB对OC的介导功能，并发挥其对骨形成的作用[16]。降钙素（CT）可抑制OC，促进OB的形成，使骨组织释放入细胞外液的钙盐减少，钙盐沉积增加。甲状旁腺激素（PTH）是一种促进骨吸收的激素，PTH能刺激OC增殖并加强其活动，还可抑制OB活动，从而使骨质溶解，减少钙盐在骨中沉积。但PTH对骨吸收的作用可被雌激素所抑制，绝经后雌激素缺乏会使骨对PTH的敏感性增加。

4.2 细胞因子 许多细胞因子能通过作用于RANKL来参与骨代谢，某些促进骨吸收的细胞因子，如M-CSF、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL）-1和IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等均可刺激RANKL大量表达，促进其与OC前体表面的RANK结合，诱导多核OC的分化成熟。某些骨保护因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、IL-7等，介导产生的OPG竞争性地结合RANKL，抑制OC分化成熟和骨吸收。

4.3 生长因子生长因子是另一类OPG/RANKL的调节器，胰岛素样生长因子（IGF-1）是骨代谢的一个重要生长因子，随年龄增长骨组织对IGF-1的反应性降低。研究表明IGF-1能促进RANKL的表达[17]。色素上皮衍生因子表达在骨组织上可以促进OB分化，可以促进OPG在OB上分泌，也可以抑制RANKL的表达从而抑制OC的分化。

4.4维生素 1， 25-（OH）2D3是促进OC形成及发挥骨吸收作用时的一种重要刺激因子，其与维生素D3受体结合可上调OB或基质细胞中RANKL的表达，而RANKL可特异性的结合RANK，激活相关信号的级联反应，促进OC前体分化、融合为OC。同时，1，25-（OH）2D3还可通过调节骨微环境 M-CSF mRNA 的表达，促使M-CSF与其受体c-Fms结合，对OC的形成及增殖具有间接促进作用[18]。1，25-（OH）2D3可刺激位于OC封闭带上整合素αvβ3的表达，而封闭带对Ca2+浓度和pH的变化较为敏感，Ca2+作为第二信使，对下游信号的调节具有特异性作用，可影响OC的形成分化及功能发挥。

5、OPG/RANKL/RANK信号通路与骨质疏松症的作用

0P依据病因可分为：1）原发性骨质疏松：是随着年龄的增长必然发生的一种生理性退行性病变，分為绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症;2）继发性骨质疏松：指因某些疾病或药物导致的骨丢失，如风湿性关节炎、药物诱导性骨质疏松症导致的骨丢失。

5.1原发性骨质疏松症

5.11绝经后骨质疏松症（PMO）PMO是由于妇女绝经后雌激素的严重缺乏，致OC活性增加，骨胶原的成熟和钙化被抑制，引起继发性钙盐减少及骨组织微结构的改变，造成的高转换型骨质疏松。雌激素可通过OPG/RANK/RANKL信号通路参与调节OC生成和抑制骨吸收作用。雌激素主要通过两条途径影响骨代谢：1）雌激素通过与OC和OB上的雌激素受体（ER）结合，直接调节骨代谢。雌激素与OB表面的ER结合，促进胶原酶的分泌，释放生长因子和细胞因子来促进骨的形成。雌激素通过ER途径直接作用于破骨细胞前体或成熟的破骨细胞，抑制OC的分化、成熟及活性，诱导OC的凋亡，从而缩短OC寿命，减少OC数量，抑制骨吸收。2）雌激素通过与ER结合，调节各种细胞因子的分泌，如：OPG、M-CSF等。雌激素还可以负调控炎症因子（如白细胞介素1、肿瘤坏死因子α的产生，以及上调转化因子β的表达促进OC的凋亡[19]。

5.12 老年性骨質疏松症 老年性骨质疏松症是随着年龄的增加，体内干细胞向脂肪细胞转化，OB的成分和功能下降，呈现成纤维细胞的重分化状态，而OC在多种细胞因子的调控下分化增加，导致骨代谢轴失衡，造成的低转换型骨质疏松。另外OPGmRNA表达降低和RANKLmRNA表达增高可能是增龄性骨流失的重要原因之一 [20]。通过观察老年性骨质疏松患者血清细胞因子水平发现，体内的细胞因子通过影响骨髓微环境内OPG/RANKL的比率来调节骨代谢。TNF-α在骨代谢中扮演着重要角色，能够促进M-CSF和RANKL的表达。TNF-α通过增加M-CSF的受体c-fms在骨髓前体细胞表面的表达来调节骨髓中破骨前体细胞的充裕量 [21]。IFN-γ是OC分化的启动因子，可以促进组织相容性复合体II类抗原（MHC-II）的表达，进而促进T细胞的增殖与活化，导致RANKL、TNF-α的高表达，致使OC的分化，诱发OP。

5.2继发性骨质疏松症

5.21风湿性关节炎（RA） RA是一种常见的慢性全身性炎性疾病，属于自身免疫性疾病。研究发现，在RA病人病灶部位发现大量OC前体和成熟OC，证明OC与RA密切相关。OC的过度增殖和异常活跃打破骨代谢平衡，使骨吸收占优势，增加RA的风险。而OPG/RANKL/RANK信号通路可以直接调节OC的功能和活性。Geusens等[22]研究发现RANKL/OPG比值高的RA患者关节破坏程度要明显高于对照组。Gurban等[23]研究证实RA病人关节中存在sRANKL含量升高和OPG水平下降，可能是RA骨质破坏的分子生物学基础。此外，OC介导的骨破坏是通过细胞间相互作用和多种细胞因子调控而实现的，炎症关节产生的促炎因子主要有：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-11、TNF-α，促炎因子可上调RANKL和RANK水平，促进OC发育，从而加剧骨吸收作用[24]。值得关注的是研究发现IL-6可以通过诱导OB和激活的T细胞表达RANKL来间接促进OC分化和成熟 这可能和风湿性关节炎软骨退化和关节破坏的发生机制有关[25]。

5.22 糖皮质激素性骨质疏松症（GIOP）GIOP在药物导致的骨质疏松症中最为常见。目前GIOP发病率仅次于绝经后OP和老年性骨质疏松症，位居第3位。糖皮质激素除了通过促进OB和骨细胞凋亡、降低成骨功能，抑制骨胶原及促进OC生成并延长其生存时间等直接抑制成骨，还可通过调节相关的细胞因子抑制骨局部血流量间接影响骨形成[26]。研究显示人成骨细胞和骨细胞具有糖皮质激素受体，糖皮质激素可通过受体介导作用直接抑制OB的功能，诱导OB和骨细胞的凋亡，减少骨质的形成。研究发现地塞米松通过下调磷酸化c-Jun蛋白和磷酸化的p46同型Jun N端激酶来下调OB中OPG的表达，同时上调RANKL基因的表达。张彦秋等[27]的实验动物研究显示使用高剂量糖皮质激素后RANKL蛋白表达水平明显升高，OPG蛋白表达水平明显下降，同时大鼠骨组织中骨小梁紊乱并存在骨折，脂肪细胞空泡变性，骨髓腔水肿，造血细胞稀少，骨小梁周边OB数量减少，多核OC增多。说明大剂量糖皮质激素诱发了骨质疏松的发生。研究结果表明hRANKL敲除老鼠，通过抑制OPG/RANKL/RANK能防止激素性骨量减少和强度下降。综上，糖皮质激素不仅能促进OC生成和抑制OPG产生，并且刺激OB谱系产生OPG受体，与RANKL竞争OPG，从而促进骨的吸收导致骨量减少，骨强度降低。

6、OPG/RANKL/RANK信号通路在抗骨质疏松治疗药物中的研究进展

OPG/RANKL/RANK信号通路是调节骨形成和骨吸收的关键信号通路，其在调节骨代谢方面的作用使其相关信号分子成为预防和控制OP备受关注的治疗靶点。外源性的OPG、Fc-OPG、抗RANKL抗体及RANK-Fc融合蛋白等拮抗剂能够有效地抑制RANKL对OC的作用。外源性OPG可抑制诸多刺激OC的因素从而抑制动物和人体的各种骨质疏松模型。用重组OPG是提高OPG含量最直接的途径之一，基因重组OPG应用于卵巢切除小鼠骨质疏松模型，其胫骨骨密度有明显升高。研究证实重组的OPG与抗体Fc段融合的镶嵌抗体OPG-Fc，具有抗骨吸收的作用，对OC的发育、分化和存活具有多重效应，能呈剂量依赖性抑制绝经后妇女骨吸收。通过基因转染技术治疗肿瘤和骨吸收等代谢性骨病中骨改建速率有一定的进展，研究证实OPG与RANKL基因转染技术的应用能显著增强成骨及骨改建的速率。此外，RANKL全人源单抗denosumab已进入临床阶段，用于低骨量骨质疏松女性，能显著降低绝经后妇女的骨转换标志物水平，增加其骨密度。

7、结语

OP及其并发症给社会带来了严重的精神及经济负担，而OP的控制与治疗相当有限，故OP的发病机制及防治受到了越来越多的医生和研究者的关注。OPG/RANKL/RANK信号通路是近几年骨细胞分子生物学领域最为重要的发现之一，OPG/RANKL/RANK信号通路与OC的分化、活化及成熟之间存在着密切的关系，并且调控着OC骨吸收作用及OB骨形成作用之间的平衡，这为OP提供潜在的以细胞为基础的治疗新途径。该信号通路的发现不仅阐明了OP的发病机理，而且其在骨骼正常生理活动中扮演着重要的角色，与多种骨疾病密切相关，深入研究此信号通路的调控机制，有助于新药的研发和治疗手段的更新。

参考文献

[1] Shanb AA，Youssef EF.The impact of adding weight bearing exercise versus nonweigt bearing programs to the medical treatment of elderly patients with osteoporosis[J].Family Community Med，2014，3：176-181.

[2] Strom O，Borgstrom F，Kanis JA，et al.Osteoporosis： burden，health care provision and opportunities in the EU： a report prepared in collaboration with the international osteoporosis foundation （IOF） and the European federation of pharmaceutical industry associations （EF-PIA）[J]. Nat Rev Rheumatol，2010，6（2）： 99-105.

[3] 喻明丽. OPG/RANK/RANKL系统在骨质疏松中的研究进展[J].昆明医学院学报，2012.（1B）：194-197.

[4] Boyce B F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast

Functions.J Dent Res，2013，92（ 10） ：860-867.

[5] 黎彦龙，何明，陈秉雄.OPG-RANKL-RANK信号系统是调节OC及OP的重要途径[J].中国组织工程研究，2015.19（24）：3894-3898.

[6] 郭梁.OB、OC及OPG/RANKL/RANK轴与OP[J].中医正骨，2010.22（7）：41-47.

[7]  Simonet WS.Lacey DL，Dunstan C.et al.Osteoprotegerin：A novel secreted protein involved in the regulation of bone density.Cell.1997;89（2）：309-319.

[8] van Roij MH，Mizumoto S，Yamada K，et al.Spondyloepiphyseal dysplasia，O mani type：Further definition of the phenotype.Am J Med Genet.2008;146A（18）：2376-2384.

[9] Greene ND，Stanier P，Copp AJ.Genetic of human neural tube defect.Human Mlecular Genetics.2009;18（R2）：R113-129.

[10]Sun M，Fink PJ.A new class of reverse signaling costimulators belongs to the TNF family [J].J Immunol，2007.179（7）：4307-4312.

[11] Ostrowski MC.A new role for OPG： putting RANKL in its place[J].J Bone Miner Res，2010，25（ 9） ：1905-1906.

[12] 李应福，李宁. OPG/RANK/RANKL系统在骨质疏松中的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2016.22（1）：115-119.

[13] Lacey DL，Tan HL，Liu I，et al.Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in nitro and vivo.Am J Pathol.2000;157（2）：435-448.

[14]任莉荣，徐永清.OC分化机制的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2015.21（12）：1522-1525.

[15]Guo L J，Liao L，Yang L，et al.MiR-125a TNF receptor-associated factor 6 to inhibit osteoclastogenesis[J].Exp Cell Res，2014，321：142-52.

[16]张川， 李孝鹏等.雄激素对体外OBOPG及其配体基因表达的影响[J].中国骨质疏松杂志，2007.13（2）：77-81.

[17] Cao JJ.Kuimoto P.Boudignon B.et al.Aging impairs IGF-1 receptor activation and induces skeletal resistance to IGF-1[J].J Bone Miner Res，2007.22（8）：1271-1279.

[18] Zhao Q， Shao J， Chen W，et al. Osteoclast differentiation and  gene regulation[J]. Front Biosci， 2007， 12： 2519-2529.

15-119.

[19]  Miranda-Carboni GA，Guemes M，Bailey S，et al.GATA4 regulates estrogen receptor-alpha-mediated osteoblast transcription.Mol Endocrinol.2011：25（7）：1126-1136.

[20] CaoJ，VentonNL，Sakat AT，et al.Expression of RANKL and OPGcorrelateswithage-relatedbonelossinmaleC57BL/6mice[J].J Bone Miner Res，2002，18（ 2） ：270-277.

[21]郑青，梁宁.老年性骨质疏松患者血清细胞因子水平与OPG/RANKL/RANK轴的相关性[J].中国老年学杂志，2012：17（32）：3651-3653.

[22] GeusensPP， LandewéRB， Garnero P， et al. The ratio of circulating osteoprotegerin to RANKL in early rheumatoid arthritis predicts later joint destruction.ArthritisRheum，2006，54：1772-1777.

[23] Gurban C Gotia S Gotia L et al. Synovial fluid OPG RANKLratio in arthritis diseases[J]， Curr Opin Biotech， 2011， 22（1）：S110.

[24] 孔祥鹤. OPG/RANK/RANKL系统与骨质疏松中研究最新进展[J].生命科学研究，2011.15（1）：80-85.

[25] 李盛村，鲍捷，等.IL-6 与 OPG/RANKL/RANK信号通路在风湿性关节炎发病机制中的作用[J].现代预防医学，2013.40（5）：933-935.

[26] 任辉，魏秋实，等.糖皮质激素性骨质疏松的研究新进展[J].中国骨质疏松杂志，2014.20（9）：1138-1142.

[27] 张彦秋，王春生，等.長期应用糖皮质激素对大鼠骨组织中HMGB1、RACE、OPG和RANKL表达的影响[J].吉林大学学报：2015.41（5）：907-913.