多粘类芽孢杆菌ARTP诱变及高产菌株的选育

闵勇 王颖 刘晓艳 陈伟 刘芳 杨自文 王开梅 周荣华?

摘   要：多粘类芽孢杆菌NBF188对番茄青枯病菌的病原菌茄科劳尔氏菌具有显著抑菌效果。采用常温常压等离子体诱变（ARTP）的方法处理该菌株，筛选得到高产菌株NBF188-R。NBF188-R抑菌效果较出发菌株有显著的提高，HPLC-MS检测显示其多粘菌素的产量提高了106.2%。

关键词：多粘类芽孢杆菌;番茄青枯病菌;常温常压等离子体诱变;多粘菌素

文章编号： 1005-2690（2019）13-0040-02       中图分类号： TQ925.4       文献标志码： B

多粘类芽孢杆菌能产生多肽类抗生素，统称为多粘菌素，于1947年被發现[1-2]。多粘菌素以非核糖体肽形式合成，能与存在于细胞膜上的脂多糖作用，破坏细胞膜磷脂双分子层的结构，因此对革兰氏阴性细菌具有较强的抑制作用[3]，且多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，细胞壁不含内毒素，在产品开发中活菌数量高、性能稳定，是一种理想的生防菌，同时具有促进作物根系生长的作用，目前在农业和医学上均有广泛的应用[4-5]，在农业生产上，多粘类芽孢杆菌主要用于茄果类蔬菜青枯病的防治。茄果类青枯病是一种毁灭性的土传性病害，俗称植物“癌症”，是由茄科劳尔氏菌引发的一种生理性病害。

菌种选育是一种将菌株经过物理或化学诱变处理后，筛选得到产量提高的正突变菌株的技术。其中紫外线照射处理和化学物质处理是常用的诱变手段。常压室温等离子体（ARTP）作为一种方便快捷的诱变手段，在菌种选育中被广泛地应用，已有许多试验证明该方法能够高效地筛选得到正突变菌株[6-7]，不过由于一些突变体不稳定，后期选择合适的筛选方法和遗传稳定性验证很关键。

试验选用一株能有效抑制茄科劳尔氏菌生长的多粘类芽孢杆菌NBF188，采用常压室温等离子体诱变（ARTP）的方法进行诱变育种，同时通过高通量筛选获得高产菌株，为其在田间应用提供理论基础。

1   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   番茄青枯病原菌菌株

试验所涉及的番茄青枯病病原菌分离自发病的番茄植株。发病的番茄植株取自湖北省农业科学院经济作物研究所蔬菜实验基地。

1.1.2   生防菌来源

多粘类芽孢杆菌NBF188，由湖北省生物农药工程研究中心保藏。

1.2   试验方法

1.2.1   平板抑菌测定筛选生防菌

将番茄青枯病病原菌及多粘类芽孢杆菌NBF188分别接种于SPA和LB液体培养基，置于30℃振荡培养过夜，将培养好的菌液调整OD600至1.0后备用。吸取0.1mL番茄青枯病病原菌作为指示菌，加入200mL融化好的NA培养基中，混匀后倒平板。将圆形滤纸片平铺于培养基表面，吸取5μL的NBF188菌液滴在滤纸片上，30℃培养箱中培养48h，每个样品设置3个重复。待能观察出明显的抑菌圈时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算平均值。

1.2.2   生防菌的ARTP等离子体诱变及筛选

参照ARTP标准诱变流程处理筛选出来的生防菌。将菌株摇瓶培养至对数期，此时OD600值为0.5，取10μL菌液均匀涂抹于金属载片，将载片移至ARTP诱变育种仪操作室，照射间距约为2mm。设置仪器诱变功率为100W，气流量为10SLM。设置不同的处理时间分别为20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，制作致死率曲线确定最佳的诱变条件。致死率=（未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数）/未经诱变菌落数×100%。选择最优辐照时间，将诱变菌液梯度稀释后涂布于LB平板，确定最佳诱变和生长条件。

挑取至少500个生长出来的单菌落接种于LB液体培养基，摇床上振荡培养24h。将培养出来的菌液进行平板抑菌效果测定，根据抑菌圈大小初步判断高产菌株。将初筛出的菌株接入LB液体培养基中摇瓶培养48h，并采用HPLC-MS液质联用的检测方法准确的测定菌液中多粘菌素的产量，从而筛选出5株高产量的诱变菌株。最后对这些5株诱变菌株分别传代3次验证其遗传稳定性。

2   结果与分析

2.1   生防菌NBF188的ARTP等离子体诱变

根据致死率公式，以诱变时间为横坐标，制作致死率曲线。从图1中可以看出，等离子体照射处理生防菌NBF188的时间与其致死率存在明显相关性。照射时间50s时致死率为91.9%，照射超过60s后致死率为99%左右。经过测定，致死率在90%左右NBF188有较高的正突变率，所以50s为合适的生防菌NBF188菌株照射处理时间。稀释倍数为10-4时菌落数量最好统计，总共挑取不少于500个单菌落进行平板抑菌筛选。

2.2   ARTP 诱变后高产菌株的筛选

经过3次传代试验筛选得到的5株抑菌效果最好、且遗传稳定性较好的诱变菌株，重复测定抑菌效果。原始菌株作为对照（CK），对茄科劳尔氏菌的抑菌效果及HPLC-MC检测的多粘菌素特征峰面积结果如表1。其中3号较原始菌株的峰面积比为206.2%，抑菌效果及多粘菌素产量均为最好。将其命名为NBF188-R。

3   小结与讨论

多粘类芽孢杆菌可产生强抗逆性的内生芽孢，抑菌谱广，对真菌、细菌、线虫等引起的植物病害具有防治效果，还能促进植物根际定植，对植物具有促生作用，可增强土壤的通透性，是极具开发潜力的生防菌[8-14]。本试验通过等离子体诱变筛选到一株高产菌株NBF188-R，将多粘菌素的表达产量提高了1倍，在后续试验中可以增加田间试验，进一步验证菌株NBF188-R防治番茄青枯病的效果。

参考文献：

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（收稿日期：2019-09-15）