超高效色谱-串联质谱法测定奶粉中三聚氰胺的不确定度评定

林显活

摘 要：对《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》测定奶粉中三聚氰胺的不确定度进行了评定，分析和量化影响测定结果的不确定度分量，将不确定度分量合成，得到奶粉中三聚氰胺含量的扩展不确定度为

1.75 μg·kg-1。

关键词：奶粉;三聚氰胺;超高效色谱-串联质谱;不确定度

Abstract：The uncertainty of measurement in determination of melamine in milk powder was evaluated according to the method for determination of melamine in raw milk and dairy products by UPLC-MS/MS. The components of uncertainty were analyzed， quantified and composed. The expanded uncertainty of melamine in milk powder is 1.75 μg·kg-1.

Key words：Milk powder; Melamine; UPLC-MS/MS; Uncertainty

中图分类号：O657.7

测量不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数，是衡量测试结果准确性和可靠性的重要参数。在ISO/IEC17025：2005-5-15《检测和校准实验室能力的通用要求》中对测量不确定度的评定作出了明确要求。随着测量不确定度被广泛的认识和接受，本文通过GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》对实验室测定奶粉中三聚氰胺含量的不确定度进行评定，对影响测定结果的不確定度分量进行分析和量化，求得测定结果的标准不确定度和扩展不确定度，并对测量结果进行了表述。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

（1）仪器。Quattro Premier XE超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS），美国Waters公司生产;HU-20500D超声波清洗器，天津恒澳科技发展有限公司生产;电子天平;离心机。

（2）试剂。标准物质：三聚氰胺，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、甲醇，均为色谱纯，购自美国Fisher公司;三氯乙酸，分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 奶粉中三聚氰胺的测定方法

按照GB/T 22388-2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》测定奶粉中的三聚氰胺，称取1 g样品，用1%三氯乙酸提取，乙酸锌沉淀蛋白，离心过滤后，以固相萃取小柱净化，氮吹仪吹干，最后定容至1 mL，过膜，LC-MS/MS检测，外标法定量测定奶粉中的三聚氰胺。

1.2.2 测试条件

（1）色谱条件。色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100×2.1 mm;柱温：35 ℃;进样体积：5 μL;流动相：A为0.1%的甲酸-水溶液，B为乙腈;流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脱：0～2.5 min，95%A;2.51～3.0 min，10%A;3.1～4.5 min，95%A。

（2）质谱条件。电离方式：电喷雾正离子（ESI+）模式;扫描方式：多反应监测（MRM）;毛细管电压：3.5 kV;离子源温度：120 ℃;脱溶剂温度：350 ℃;脱溶剂气流：N2，流速600 L·h-1;锥孔气流：N2，流速50 L·h-1;碰撞气：氩气，流速0.12 mL·min-1。

1.3 不确定度分量的主要来源及数学模型

本方法的不确定主要来源有：①样品称量不确定度。②样液定容体积不确定度。③标准溶液配制及稀释时引入的不确定度。④线性回归方程引入的不确定度。⑤回收率不确定度。⑥LC-MS/MS定量校准引入的不确定度。

2 不确定度量化

2.1 样品称量不确定度

称取样品1.207 6 g，天平的精度为0.000 1 g，允许误差为±1 mg，取矩形分布（又叫均匀分布），则不确定度

2.2 样液定容体积不确定度

样品经萃取、净化后用1.0 mL单标刻度的移液管定容至1.0 mL。

校准：根据校准规程标准JJG 196-2006 《常用玻璃量器检定规程》给出的1 mL单标刻度移液管（A级）的容量允差为±0.007 mL，取矩形分布，则定容体积引入的不确定度：

2.3 标准溶液配制及稀释引入的不确定度

称取三聚氰胺标准品用50%甲醇定容于50 mL容量瓶（A级）中，配制成100 μg·mL-1的储备液。用

1 mL可调移液器吸取0.50 mL，置于10 mL容量瓶

（A级）中，用50%甲醇定容，配制成5μg·mL-1的中间标准储备液。再用1 mL可调移液器吸取系列体积的5 μg·mL-1的中间标准储备液于50 mL容量瓶中，定容稀释成系列浓度的标准工作液。其浓度计算公式为：

式（4）中：ci-工作标准溶液的浓度，ng·mL-1;mi-称取的标准品的质量，g;pi-标准品的纯度（质量分数）;V50-标准储备液定容时的容量瓶体积，mL;V10-中间标准储备液定容时的容量瓶体积，mL;Vvipe-可调移液器的体积，mL;V50-标准物质工作液定容时的容量瓶体积，mL。

2.3.1 标准品纯度

pi=99%，扩展不确定度为0.5%，扩展因子为2，则相对不确定度计算如下：

2.3.2 标准品称量

称取三聚氰胺10.25 mg，使用的天平精密度为0.01 mg，允差为±0.1 mg，取矩形分布，则相对标准不确定度：

2.3.3 标准溶液配制与稀释过程的体积引入的不确定度

（1）50 mL容量瓶体积：根据校准规程JJG 196-2006《 常用玻璃量器检定规程》，20 ℃时50 mL容量瓶（A级）的容量允差为±0.05 mL，取三角分布，则标准不确定度为

重复性：对50 mL容量瓶充满20次并称量的实验，得标准偏差为0.090，直接作为标准不确定度。

温度：甲醇的热膨胀系数为1.43×10-5 ℃-1，水的热膨胀系数为2.07×10-4 ℃-1，容量瓶在20 ℃校准，本实验是在25 ℃条件下进行，容量瓶和溶液温度与校准时不同所引起的体积变化为

（2）10 mL容量瓶体积：根据校准规程JJG 196-2006 《常用玻璃量器检定规程》，20 ℃时10 mL容量瓶（A级）的容量允差为±0.020 mL，取三角分布，则标准不确定度为：

重复性：对10 mL容量瓶充满10次并称量的实验，得标准偏差为0.022，直接作为标准不确定度。

（3）1 mL可調移液器的体积Vvipe：根据校准规程JJG 646-2006《移液器检定规程》，1 mL可调移液器在0.50 mL检定点的容量允差为±1.0%，按矩形分布，则标准不确定度为：

重复性：校准规程JJG 646-2006给出的重复性RSD≤0.5%，得标准偏差S≤0.50×0.5%=0.002 5 mL，

即为其标准不确定度。合成：

1 mL可调移液器移液点体积Vi：体积校准：各移液点体积的容量允差、分布类型及不确定度计算见表1;重复性：1 mL可调移液器各相应移液点体积重复性引起的不确定度计算见表2;合成：1 mL可调移液器移液点体积合成不确定度见表3。

2.4 线性回归方程引入的不确定度

配制一系列三聚氰胺标准溶液，浓度分别为10、20、50、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1，定量离子的峰面积分别为：2 246、4 909、1 0121、20 217、40 988。线性回归方程为：Y=202.9X+231.66，r=0.999 6。对样品平行测定6次，由线性回归方程计算出样品的平均浓度为c0=12.24 ng·mL-1。标准溶液系列浓度的平均值cs=76ng/mL，则由最小二乘法拟合标准工作曲线引入的标准不确定度为：

当t检验值大于等于临界值t95（8）=2.31时，R与1.0有显著性差异，回收率校正因子必须在公式中采用，以修正结果;当t检验值小于临界值t95（8）时，R与1.0无显著性差异，不需要采用校正因子来修正结果。本实验中t检验值大于t95（8）=2.3，需要采用校正因子fr来修正结果。

2.6 LC-MS/MS仪器定量校准

仪器商提供的LC-MS/MS定量的允差为5%，取矩形分布，则相对不确定度为：

3 相对标准不确定度的合成与扩展

当上机试液中三聚氰胺含量为12.24 ng·mL-1，称样量为1.207 6 g，定容体积为1.0 mL时，样品中三聚氰胺的质量浓度w为10.14 μg·kg-1。

合成标准不确定度为：u（X）=w×ur（X）=10.14×

0.086 5=0.877 μg·kg-1。

取包含因子k=2，置信概率p=95%，则扩展不确定度为u=2×0.877=1.75 μg·kg-1。引入校正因子fr=88.4%，则三聚氰胺的含量为10.14÷88.4%=11.47 μg·kg-1。

4 测定结果报告

该奶粉样品中三聚氰胺含量为（11.47±1.75）μg·kg-1。