益生菌的筛选评价与产品质量控制探讨

蒋卉

摘 要：益生菌制剂作为一种无毒、无副作用的新型保健品，在人体中发挥着重要的作用，直接关系着人体的机能和生命健康。然而，我国益生菌产业起步较晚，技术尚不成熟，且缺乏健全完善的标准，市场监控不到位，使得益生菌的产品质量问题受到广泛关注。本文以益生菌的筛选评价指标（即菌株的选择标准、有效性评价和安全性评价）及产品质量控制为出发点，对益生菌產品生产现状、存在的问题和对策进行了探讨。

关键词：益生菌;菌株筛选;有效性;安全性;质量控制

Abstract：As a new type of health care product without toxicity and side effects， probiotics preparation play an important role in human body and are directly related to human function and life health. However， the probiotics industry started late in China， the immature technology， the lack of perfect standards， and the lack of market monitoring， the quality of probiotics has received widespread attention. In this paper， starting from the screening evaluation index of probiotics and product quality control， the production status， existing problems and countermeasures of probiotics products were discussed.

Key words：Probiotics; Strain screening; Effectiveness; Security; Quality control

中图分类号：TS201.3

近年来，随着微生态理论研究成果在实践中的不断应用，益生菌得到了迅速发展。在我国，益生菌除了部分用于医药产品外，大部分都用于保健食品。益生菌作为维持人体生命活动和身体机能的有益物质，不仅对人类健康发挥着重要的作用，也有效保证了人体生命体征的稳定运行，同时作为一类生物活性制品，需保证益生菌菌株的稳定、有效、安全。

世界卫生组织对益生菌的定义为：一类在摄入适当数量后会对宿主机体产生益处的活体微生物。近年来，市场对益生菌的需求量日益增加，人们对其质量标准问题的关注度也日益提升，但我国还没有明确规定相应的评价指标和评价方法。大部分企业在研发益生菌产品时，不对菌种进行全面的安全性评价，且不同国家研究人员采用不同的评价指标和评价方法。目前，益生菌产业处于发展阶段，不仅种类多，而且难以管理。因此，需要严格把关益生菌产品的生产过程，以确保益生菌的有效性和安全性。本文结合益生菌菌株的选择标准、有效性评价、安全性评价，产品的质量控制现状、实际存在的问题及其对策进行了探讨。

1 益生菌菌株的筛选

菌种是决定益生菌质量的最关键因素。为保证筛选的益生菌菌种安全、高效，需确定菌种的生物学及其功能特性。对微生态制剂发展来说，益生菌的选择标准和评价规程的建立非常重要。

1.1 益生菌菌株的选择标准

1.1.1 安全性

益生菌菌种应来源清楚，有准确的分类，其本身没有毒性、致病性和传染性，包括代谢活动和内在微生物的属性[1]，基因相对稳定，不易突变，不会对环境造成污染，符合国家相关法律法规。

1.1.2 抗逆性

益生菌菌株应对高温、高湿、胃酸、消化酶和胆盐等环境有一定的耐受性，其生物活性得到保证，才能保证进入人体发挥益生功能，保护肠道微生态平衡。

1.1.3 定植性

益生菌菌株能够在消化道黏膜黏附并存活、稳定定植在黏膜表面和产生代谢活性（如产生消化酶、有机酸等）。菌株能与常驻菌群竞争，产生抗菌物质，还能与病原菌拮抗，具有调控免疫反应的能力。因此，把益生菌在肠道黏附的定植性作为检验其应用效果好坏的重要指标。

1.1.4 稳定性

益生菌菌株具有遗传稳定性，尤其是经过驯化、诱变和基因重组的菌种，应具有稳定的生物学和遗传学特性，突变率低，避免产生毒副作用[2-3]。同时，菌株应具有较好的可控性，确保在加工、贮藏和运输的过程中能维持其功能特性的稳定性，使益生菌具有良好的活性、理想的风味和工艺特性。

1.1.5 有效性

益生菌能发挥至少一种有科学依据支撑的可促进健康的作用。选择益生菌时，必须根据生理需要，选择可在人体中发挥作用的益生菌，以确保其应用效果。

1.2 菌株的有效性评价

1.2.1 对胃酸、胆酸耐受性分析

人体胃酸（pH为2.0～3.0）环境能够杀灭摄入的大部分微生物[4]。为保证益生菌在胃肠道内发挥益生作用时的活菌数目，耐酸能力是益生菌必备的特征。目前，国内外对菌株的耐酸试验还没有统一的标准，通常选择pH为1.0～5.0。

益生菌产品的特征指标之一是益生菌对胆盐的耐受性。人体小肠中胆汁酸盐浓度水平平均在0.3%[5-6]，该指标是影响菌株存活率的重要因素。胆汁盐的耐受性随着益生菌种类的不同而有所差异。目前，国内外对菌株的耐胆盐试验还没有统一的标准，通常选择胆盐浓度在0.1%～1.0%范围内。

1.2.2 对温度耐受性分析

对温度耐受性强的菌株，其产品的保质期也更长。将活化的待测菌株在一定温度下水浴一定时间，随后在冷水中快速降温，经培养后检测菌株的存活率。

1.2.3 黏膜/上皮细胞黏附性分析

黏附试验常选人肠道细胞、猪肠道细胞和鸡肠道细胞作为研究模型。黏附性的分析方法有：①贴壁共培养测定活菌数。将待测菌与细胞共培养，清洗去除未黏附的细菌后，处理细胞，释放黏附在细胞上的待测菌[7-9]，通过测定活菌数，计算黏附率。②贴壁共培养染色观察计数。将待测菌与细胞共培养，清洗去除未黏附的細菌后，采用甲醇固定，经革兰氏染色或吉姆萨染液染色，使用显微镜观察并计算黏附率。③悬浮培养染色观察计数。制备鸡上皮细胞和猪上皮细胞，将等体积的菌悬液与其混匀，倒置显微镜下观察细菌黏附情况。④黏蛋白模拟。将无菌聚丙烯管或微孔板用黏蛋白包被，加入待测菌，孵育、洗涤后，通过测定活菌数，计算黏附率。

1.2.4 对致病菌的抗菌活性分析

2002年，世界卫生组织制订的食品益生菌评价指南提出：益生菌代谢产物要有有效的抑菌活性[10]，益生菌对胃肠道固有病原菌的抑菌特性是一重要评价指标。铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等是用于测定益生菌抑菌活性的病原指示菌。检测方法概括有：①牛津杯法。将不同指示菌涂布于平板，并放置在牛津杯中，加待测菌的上清液，培养后，根据测定的抑菌圈直径判断抑菌活性。②双层平板法。待测菌培养液点种于平板上培养，经氯气处理，将加有指示菌的软琼脂倾注于改良平板表面，培养后，测定抑菌圈直径。③琼脂扩散法。将加有指示菌的软琼脂倾注于琼脂平板上，在平板培养基上打孔，将待测菌上清液或菌泥重悬液加至孔中，培养48 h测定抑菌圈的大小。④点种法。在软琼脂培养基中加入指示菌液，将待测乳酸菌液点种于琼脂平板（涂布指示菌）表面，培养后，测定抑菌圈直径。⑤挖块法。在平板培养基上涂布指示菌，将待测菌株在其相应的平板上培养后，打孔，用牙签挑取长有待测菌的琼脂块点至琼脂平板（涂布指示菌）上，培养测定抑菌圈直径。⑥滤纸片法。在滤纸片上液加待测菌，置于琼脂平板（涂布指示菌）上，培养测定抑菌圈直径。

1.3 菌株的安全性评价

针对益生菌的不同特性，国内外学者提出了多种益生菌菌株安全性评价方法。以下着重对粮农组织（FAO）/世界卫生组织（WHO）在2002年建立的安全性评估指导规则中推荐的益生菌安全测定实验进行论述。

1.3.1 抗生素耐药性谱测定

耐药性是筛选益生菌的重要指标之一，研究表明，抗性基因可以在食物和肠道环境中发生转移。因此，符合要求的益生菌应同时具备：①无耐药等有害基因。②不能通过遗传修饰获得有害基因。③不能具有将有害基因转移的潜力。

1.3.2 溶血性测定

菌株是否有溶血性是筛选益生菌的先决条件。应使用特异性免疫血清进行定量凝集试验（凝集效价不低于原效价一半）。血平板培养是常见的溶血性的评价方法。①α-溶血：又称草绿色溶血，菌落周围的培养基出现草绿色环。②β-溶血：菌落周围形成界限分明、完全透明的溶血环。③γ-溶血：菌落周围的培养基没有变化。

1.3.3 产毒能力测定

益生菌产毒能力也是影响安全性的重要因素。检测的主要指标是生物胺。通常采用的方法有：①表型检测。有固体培养检测和液体培养检测，观察培养基的颜色变化或者高效液相色谱定量测定培养结束后产生的生物胺。②基因检测。对与生物胺产生有关的基因（如酪氨酸脱羧酶等）通过多重PCR的方法进行检测。综上，结合表型检测和多重PCR检测，可以提高菌株产生物胺评价的准确性。

1.3.4 毒力因子测定

通过检测参与毒力因子形成的相关毒力基因可实现毒力因子的检测。某些菌株会产生肠毒素、表面活性素、呕吐毒素等物质，需要测试毒素生产情况和安全性。

2 产品质量控制

益生菌产品的生产工艺复杂且技术含量高。因此，想要生产出高质量的益生菌产品，必须使用通过有效性、安全性评价的菌种，采用的生产工艺必须科学稳定。

2.1 物理性状检查

益生菌类产品应有均一的外观和色泽，大小一致的颗粒，可有轻微的酸味、芳香味等，但不可有刺鼻异味。若益生菌类产品散发出酸香味且没有霉味，可初步判断该产品中活菌数较充足，且霉菌量少，质量较好。

2.2 含一定数量的有效微生物

益生菌的活菌数是益生菌类产品重要的质量指标。为保证对原有肠道微生态系统产生影响，必须保证进入肠道的益生活菌数达到1×107～1×1010个/g（mL）。活菌数的检测手段包括平板计数法、免疫法、显色培养基法和生物化学发光检测方法等。根据不同菌种的培养要求，选择适宜条件和培养方法。

2.3 水分控制

益生菌类产品中的水分含量是影响制剂质量的重要指标。若环境中水分含量较高，则益生菌代谢旺盛，养料消耗快，益生菌易死亡。故益生菌类产品中水分含量要控制在3%以下。不同菌种的益生菌类产品，其含水量要求也有差异。

2.4 卫生指标检测

益生菌类产品的卫生指标是指其中的有害微生物及有害物质。必须严格控制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病性菌的污染，同时防止包括真菌毒素、重金属等有害因素的污染。

2.5 产品保存期

益生菌类产品保存期一般是指在一定保存条件下，能够保持益生菌达到规定活菌数的最长时间。不同益生菌产品的保存期和保存方式都不同。随着保存时间的延长，益生菌类产品活菌数逐渐减少。活菌对光、热和潮湿较为敏感，真空厌氧包装和冷藏可延长益生菌类产品保存期。

3 存在的问题及其对策

3.1 菌种使用不规范

目前，我国的益生菌筛选工作存在很多问题，如菌种来源不明、菌种生物特性不清、菌株信息不透明、生产缺乏规范性等。为了片面追求产品的高菌数含量，一些厂家采用多种菌共同作用，包括一些未经批准、安全性未知的菌种，导致益生菌产品质量参差不齐，应用效果不佳。甚至还有生产厂家盲目连续传代菌种，导致菌种代次已严重超过其有效代次，还有些菌种遗传稳定性不明确，这些可能对产品质量及其临床应用效果带来风险。

3.2 評价标准和质量标准尚不健全

目前，缺乏益生菌的具体制造标准和检验规程导致厂家生产工艺较随意，质量检测不规范，造成益生菌产品品质不稳定，活菌含量低，缺乏有效活菌数，因而导致应用效果无法保证。

充分评估益生菌的有效性和安全性是将新开发的产品商业化之前必不可少的。然而，现阶段各国对益生菌的评价方法有所不同，也没有统一的标准。我国益生菌的标准也鲜有建立，更没有建立评价规程。

4 结语

为保证益生菌类产品的品质质量，应严格从菌种的选择上保证其有效性，在生产工艺上严把质量关，同时保证可追溯性，拥有完善的质量保证体系，能够沿着供应商原料采购，工厂生产控制，成品运输这一整条线路进行监控和双向追溯。同时，随着对益生菌安全性评价方法和有效性评价方法研究的深入，迫切需要加快相关法规和标准的制定，加强益生菌产业的规范管理和行业监督管理，以保障产业持续、健康发展。

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