根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展

杨静

摘   要：在植物遗传转化研究的进展中，因根癌农杆菌具有转入的外源DNA结构完整、外源基因表达比较稳定、经济简便、技术仪器要求低等优势，成为了目前应用较为广泛的转基因技术。对根癌农杆菌介导单子叶植物的发展状况、影响因素和提高转化效率进行了综述，以期为提高单子叶植物遗传转化效率和转化技术提供参考依据。

关键词：根癌农杆菌;单子叶植物;遗传转化;研究进展

将农杆菌作为载体成功获得转基因烟草的试验发生在1983年，其后的30多年，农杆菌介导的遗传转化技术在双子叶植物的研究中得到了长足发展。之后，关于单子叶植物在这方面的研究却比较少，因为农杆菌寄主范围局限于双子叶植物和一些裸子植物。单子叶植物被认为不能作为农杆菌的宿主，所以难以被转化。因此最初人们关于单子叶植物通过根癌农杆菌介导遗传转化的研究很少，而多是采用PEG法、基因枪法及电激法等。

1   根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展

1.1   水稻

水稻作为单子叶植物研究的模式植物，关于根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究开始得比较早。水稻的遗传转化研究从完全否定其可行性，到可以进行转化，从低频率转化到高频率，经过几十年的研究发展，已经具备了相当的理论基础和研究成果，实现了许多优质的外源基因对水稻的遗传转化[1]。

李宝健证明了水稻是可以通过农杆菌进行遗传转化的，并获得了转基因的水稻，虽然其转化频率很低，却是农杆菌介导转化单子叶植物的一大突破。这之后，Hiei证明了水稻是可以被有效侵染的，他不仅利用胚性愈伤组织作外植体，还将粳稻的转化频率提高到28.3%，并建立了水稻的遗传转化体系。王春萍等[2]将ThIPK2基因通过农杆菌介导法插入到籼稻科恢675中，经验证后，通过该试验结果完善了优良的遗传转化体系。张燕红等[3]利用农杆菌介导法，将SiPEBP基因转入到秋田小町、新稻 21 号以及08GY30-5-4这3个新疆品种水稻中，试验结果表明，3个品种的抗性愈伤率皆达到了40%以上。

1.2   玉米

玉米作为三大粮食作物之一，是作为单子叶植物研究的重要对象。1996年，Ishida等[4]选用玉米自交系A188幼胚作为受体的转基因试验，获得了世界上第一株用该方法转化的转基因玉米，从而证实玉米是能够被转化的，为玉米的遗传转化研究提供了一定的理论基础。

邢小龙等[5]将 GUS作为目的基因，以玉米杂交种“郑单958”为材料，以Bar作筛选标记，试验结果表明，在侵染浓度0.6、侵染时间2 h、真空处理时间10 min的条件下，“郑单958”作为受体能有效提高转化效率。李晓丽等[6]将大豆铁蛋白ferritin作为目的基因，通过农杆菌介导成功地将其目的基因转入了玉米319茎尖组织中，从而使外源基因能够转入玉米之中，使该玉米具有了除草的抗性。

1.3   小麦

小麦是三大谷物之一，也是人类的主食之一，将其磨成面粉可以制作各种食品，也可用于制作酒类，还可制成生物质燃料。对小麦进行遗传转化研究，对提高其产量和品质具有重要的意义。

世界上第一株用根癌农杆菌介导法转化的小麦诞生于1997年。Cheng等[7]利用35S启动子、HSP70内含子组成农杆菌载体，将其插入到小麦中，最终转化率为4.3%，其转化效率还比较低，但随着研究深入以及转基因技术的发展，通过根癌农杆菌介导转化小麦的研究也日趋完善。

邓万银等将致瘤农杆菌插入到处于抽穗期小麦的叶鞘基部和穗茎中，经过21 d，小麦出现瘤状组织，该瘤状组织中有冠痰碱，并且在试验中加入乙酸丁香酮，可以增大瘤状组织和提高出现频率。Hess等利用根癌农杆菌介导法将农杆菌注入到处于花期小麦穗的小穗中，并用收获的种子进行后续萌发试验，得到了卡那霉素抗性植株，该试验证实了nptⅡ基因可以整合到小麦中并得到稳定的遗传。Xu等用酚类化合物对农杆菌作预处理，然后再用处理过的农杆菌侵染小麦的悬浮系细胞，得到了抗性愈伤组织，但数量较少，而且没有再生植株。郭丽等[8]通过根癌农杆菌介导法，将小麦成熟胚作为受体，得到了再生植株，其中3株经过报告基因GUS的PCR检测，均为阳性，并建立了相应的小麦遗传转化体系。

2   影响农杆菌转化单子叶植物的因素

2.1   Vir基因诱导物

农杆菌感染双子叶植物时会发出信号，植物的受伤部位会产生乙酰丁香酮等物质，这些物质会诱导Vir基因，从而促进T-DNA基因向双子叶植物细胞转移。而单子叶植物则不同，在受到外部伤害时，细胞会出现木质化和硬化现象，无法产生乙酰丁香酮等物质，因此许多单子叶植物并不是农杆菌的有效宿主。

水稻得以通过农杆菌介导法成功转化，一个很关键的原因是在转化过程中加入了100 μmol/L的乙酰丁香酮，使得农杆菌更加容易侵染水稻的愈伤组织[9]。Chan等[10]将马铃薯种的细胞悬浮液添加到培养基中共培养，也起到了提高转化效率的作用，这是因为马铃薯的细胞悬浮液中含有大量的酚类化合物，有助于激活Vir基因，帮助转化。

2.2   农杆菌菌株及载体系统

在将目的基因植入到受体过程中，农杆菌菌株的选择以及高效的载体系统至关重要。Hiei等[11]用了双元载体的方法，将菌株A281的Ti质粒上的VirBEG基因复制到双元载体，从而造就了超双元载体，最后结果显示水稻达到了高频率转化。在农杆菌介导转化单子叶植物的试验中，常用的超毒力菌株通常有EHA101、EHA105以及AGL-1等。刘巧泉等[12]在之后的试验中也发现，对于携带质粒pCAMBIA1301的农杆菌，EHA105的敏感度要明顯高于LBA4404和AGL-1，是转化水稻十分高效的菌株。

2.3   篩选剂的选择

卡那霉素可作为筛选剂，但是在转基因愈伤组织的筛选中作用不明显，而且筛选后的愈伤组织很多不能再生出绿色植株。Toriyama等[13]选择氨基糖苷类抗生素——G418作为筛选剂，该抗生素在筛选作用上更为高效，且不会像卡那霉素一样使经过筛选的愈伤组织失去再生绿色植株的能力。霉素磷酸转移酶基因（hpt）也是常用的筛选剂，它对氨基糖苷类抗生素——潮霉素B（Hyg）有着明显的抗性表达，能更加清楚地分辨未转化与已转化的组织，且不会导致白化、不育等现象的发生。

2.4   单子叶植物的外植体和基因

在根癌农杆菌介导法对单子叶植物的转化中，受体本身的状态和遗传背景也是影响转化的因素。虽然同为单子叶植物，但是不同的类别和品种在基因组合、生长状态、生存环境、生理代谢等方面必然也有所不同，不同的细胞甚至相同细胞在不同的状态下对根癌农杆菌的敏感性是不同的，同样，农杆菌对它们的感染性也存在着差异。植物受伤时会分泌出酚类物质，该物质的主要功能是激活农杆菌Ti质粒上的毒性区，以诱导转化，因此，外植体的选择对农杆菌转化单子叶植物有着很大的影响，选择合适的外植体，有助于提高转化效率。

易自力[14]的研究发现，农杆菌对不同品种水稻的敏感性是不同的，如粳稻品种台北309和稻品种特青，对3种菌株的瞬时表达率平均值分别为55.5%、34.8%，存在显著差别。叶兴国等[15]在农杆菌介导转化小麦的试验中，对35个小麦品种作了比较，其中的两个品种对农杆菌有较强的敏感性，分别是新春9号和PM97034。

3   提高转化效率的对策

3.1   添加表面活性剂

表面活性剂可以提高细胞膜的通透性，便于农杆菌对受体的侵染，加快T-DNA基因由农杆菌向受体的转移速度，以提高转化效率。表面活性剂在农杆菌介导转化单子叶植物中的主要功能包括：一是其双亲结构对有机物有着较强的吸引力;二是其分子在浓度较低的情况下可以吸附于两相界面，从而缓解界面张力，让分散的系统逐渐稳定。表面活性剂可分为离子型、非离子型两类，其中非离子型的表面活性剂对受体造成的伤害小，且毒性弱，故应用较为普遍。

Cheng在农杆菌介导小麦转化的试验中添加了表面活性剂，结果表明，添加一定浓度的Silwet和PluronicF-68的表面活性剂有助于提高农杆菌的侵染效果和促进外源基因的转移。但相对地，在培养液中加入浓度很低的Tween20、TritonX表面活性剂则有反作用，会为害小麦的愈伤组织。Chhabra等[16]在转化小麦的研究中，加入了0.2% Tween20的表面活性剂处理农杆菌侵染液，从而提高了小麦愈伤组织的转化效率，但表面活性剂一旦高于该浓度，转化植株的GUS瞬时表达率就会急剧下降。

3.2   添加抗氧化剂

在根癌农杆菌介导转化单子叶植物的试验中，受体细胞在被侵染的过程中会产生逆境环境，继而产生过氧化物，使受体细胞被氧化，导致愈伤组织在共培养阶段褐化，阻碍组织分化。抗氧化物可以去除细胞内的活性氧成分，起到避免细胞被氧化的作用，减少共培养阶段愈伤组织的褐化现象，促进农杆菌对受体的侵染，加快转化。

于惠敏等[17]在转化济南177小麦试验中发现，在培养过程中添加抗氧化剂二硫苏糖醇（DDT）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），有助于转化，当DTT的浓度在0.1%～0.15%，PVPP含量达到1.0%时，转化效率最高，且DTT提高转化效率的作用要明显高于PVPP。除此之外，AgNO3、半胱氨酸（Cys）、抗坏血酸（Vc）等抗氧化剂都能起到保护细胞不被氧化的作用，其中AgNO3的应用范围较广，对组织褐化有明显的阻碍作用。

3.3   整株转化

“整株培养”技术是将外源基因以裸露DNA的形式直接或通过农杆菌介导转入到完整的植株中，完成基因的转移。在农杆菌介导转化单子叶植物的试验中，组织培养的步骤繁多，而且十分耗费时间，已转化的组织还容易发生体细胞克隆变异（somaclonalvari-ations）和嵌合体（chimera）等现象。“整株转化”可以减少组织培养的步骤。“整株培养”技术在拟南芥研究上取得了巨大的成就。在水稻遗传转化的研究中，幼胚和幼穗经过预培育得到的愈伤组织可作为转化对象，不同的是，幼胚的预培育时间在3～5 d，而成熟胚盾片的预培育时间却长达30～50 d，使用幼胚培育可大大缩短试验时间。

4   结语

经过国内外学者的常年努力，根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化的研究从无到有、由浅入深、由点及面，研究体系、研究方法逐渐丰富，在许多领域取得了丰硕的成果，改良了许多单子叶植物的基因，提高了水稻、小麦、玉米的品质和产量。但与双子叶植物的研究相比，还存在着较大的差距，如可转化的种类有限、转化效率不高等，有待进一步深入。此外，根癌农杆菌介导单子叶植物的遗传转化在实践应用上也还不够广泛，转基因植物的推广，对种植业、畜牧业甚至工业方面的发展都有十分重要的意义，随着转基因技术的发展和推广，其经济效益和社会效益都会日趋显现。

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（收稿日期：2019-09-30）