血散薯内生真菌的分离鉴定及其抗菌活性研究

颜桢灵，李国萍，骆海玉，陆保屹，梁春霞，邓业成，邓志勇

(珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西珍稀濒危动物生态学重点实验室/广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006)

植物内生真菌指的是一类全部或部分生活史存在于植物健康组织或器官中，却不引起宿主植物产生明显感染病症的微生物[1-2]，其普遍存在于各种植物体中，种类繁多，分布广泛。不同宿主植物不同器官的内生真菌种类差异较大[3-11]。植物内生真菌与宿主植物协同进化、互惠互利，其不仅对植物的生长、发育、进化及生态适应性产生重要影响，还可以提高宿主植物适应恶劣环境的能力[12]。

随着传统化学药剂的长期大量使用，病虫害的耐药性日益加重，同时也引发水体污染、土壤污染、野生动物或人畜中毒等一系列生态问题，因此，寻找环境友好型的新农药迫在眉睫[13]。而植物内生真菌长期协同进化，可产生种类丰富、活性显著的代谢产物，尤其是来源于药用植物的内生真菌，已成为挖掘新型天然活性物质的宝贵资源库[14-15]。目前，已有许多研究报道药用植物内生真菌可产生萜类及其皂苷、甾体、生物碱、肽类、芳香类等具有抗菌、抗虫、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性的物质[2,16]。内生真菌中的活性物质，具有可持续利用、对自然资源破坏小等优点，可缓解自然资源短缺的问题，特别是能为保护珍稀濒危药用植物资源提供新思路，是近年来的一个研究热点[14]。内生真菌产生的次生代谢产物在植物病虫害生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐扩大[17]。

血散薯(StephaniadielsianaY.C.Wu)，别名金不换、一滴血，为防己科千金藤属植物，是我国南部及西南部地区重要的药用植物，味苦、性寒，有清热解毒、活血散瘀、止痛、抗炎、凉血、治疗蛇毒咬伤等多种药理功能[18-20]。此外，其甲醇粗提物及活性物质千金藤碱(Stephanine)和克斑宁(Crebanine)等具有显著、广谱的抗菌活性[21]。但血散薯仅生长于广西、广东、贵州南部及湖南南部等地的山谷、溪边、林中及峭壁上，分布范围窄，资源有限，加之人们缺乏对血散薯的保护意识，近年来过度采挖，已造成该资源的严重稀缺。基于共生理论，认为血散薯内生真菌可能具有多种生物活性。目前，对血散薯内生真菌的相关研究尚未见报道。因此，本研究从血散薯茎、叶中分离纯化内生真菌，对其进行鉴定，并探究其次生代谢产物的抗菌活性，以期为血散薯植物资源的保护及其内生真菌的合理开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 血散薯

2016年8月于广西来宾市金秀瑶族自治县(E109°59′34″，N24°16′10″)，采集血散薯新鲜健康茎、叶组织，标本保存于广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室。

1.2 供试病原菌

供试植物病原真菌：选取9种常见农业植物病原真菌作为供试菌株，包括贡柑链格孢菌(Alternariacitri)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘蓝黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、水稻胡麻叶斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.Nicotianae)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)。以上9种植物病原真菌除金橘砂皮病菌和贡柑链格孢菌由广西特色作物研究所提供以外，其余7种均由广西大学农学院植物病理室提供。

供试动物病原细菌：选取10种供试动物病原细菌作为供试菌株，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。以上10种动物病原菌均由桂林医学院提供，保存于4 ℃备用。

1.3 培养基

内生真菌分离培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、氯霉素200 mg/L、琼脂15 g/L、蒸馏水1 L。

植物病原真菌以及内生真菌纯化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、蒸馏水1 L。

动物病原细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂20 g/L、蒸馏水1 L。

种子液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、氯霉素200 mg/L、蒸馏水1 L。

内生真菌发酵培养基为大米固体发酵培养基：大米∶水约为1∶1(m/V)。

1.4 内生真菌分离与纯化

参考LUO等[22]、王利娟等[23]的方法，对内生真菌进行分离纯化。首先选取新鲜的血散薯茎、叶组织，用清水洗净表面，吸干表面残留水分，再按以下步骤进行内生真菌的分离：(1)在超净工作台内进行无菌操作，将血散薯茎、叶组织切片(段)。(2)将切片(段)后的血散薯组织进行表面消毒。先用75%乙醇漂洗30 s，转入无菌水中，冲洗3～4次后，放置在无菌滤纸上将多余水分吸干。再用2%次氯酸钠漂洗90 s，转入无菌水中，冲洗3～4次后，放置在无菌滤纸上将多余水分吸干。最后用0.1%氯化汞漂洗3 s，无菌水冲洗3～4次后，放置在无菌滤纸上将多余水分吸干。(3)在每个用PDA培养基制作的平板上放入3～4块已进行过表面消毒的组织片(段)。设置2组对照：一组取最后一次漂洗的无菌水100 μL加至新鲜无菌PDA平板上，涂布，逐日观察平板上是否有菌长出；另一组采用按压法，将消毒后的组织块放在新鲜无菌PDA平板上，稍加按压，放置20 min后移去组织块。每组处理设置3个平行，以验证血散薯表面消毒是否彻底，若无菌长出，则可以断定分离出的真菌来自血散薯茎、叶组织内部。(4)分离组织在恒温培养箱内，(28±1)℃暗培养1～25 d，逐日观察。待分离组织边缘长出菌丝后及时挑取，将其转入另一PDA平板培养，重复操作，直至长出的菌落形态完全一致。

1.5 内生真菌鉴定

主要采用形态学和分子生物学的方法进行鉴定。

形态学鉴定：参考文献[24]以及广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室已鉴定至属种的多种内生真菌菌株等的鉴定方法，采用不同培养基(PDA、CMA、NGA)对分离得到的内生真菌进行培养鉴定。鉴定特征包括菌落大小、形态、生长速率、菌落及培养基基质颜色、菌落边缘特征，以及菌落在显微镜下的特征(如菌丝有无分隔、分支，分生孢子形态、大小，产孢结构特征等)。

分子生物学鉴定：利用真核生物在rDNA的ITS区段的特性，即具有保守性和特异性序列的特性，通过内生真菌的rDNA-ITS序列对其进行鉴定。以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增菌株ITS碱基序列，委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行检测纯化及测序。将所获得的测序结果与NBCI数据库中的序列进行BLAST比对，选择相似度较高的菌株，进行同源性比对，并用MEGA Ⅹ软件，对ITS碱基序列进行聚类分析，利用Bootstrap进行自展次数为1 000的置信度检测，根据系统发育树中的组群关系对菌株进行分类。

1.6 内生真菌发酵培养及粗提物制备

在超净工作台上，用直径为4 mm的打孔器在已经活化好的菌落边缘处打孔，取3块菌饼接种至含有马铃薯葡萄糖液体培养基(150 mL)的锥形瓶(250 mL)中，置于恒温摇床上，(27±1)℃、130 r/min振荡培养。培养5 d后，即可得到发酵种子液。取5 mL种子液接种于事先准备好的大米培养基，放置培养箱中，28 ℃培养2个月。

将发酵产物进行干燥、粉碎处理后，用适量的乙酸乙酯分别浸泡提取3次，合并3次的提取滤液，用旋转蒸发仪浓缩蒸干，即得到次生代谢产物粗提物。

1.7 抗植物病原真菌活性测定

采用菌丝生长速率法[21]测定内生真菌发酵产物粗提物抗植物病原真菌活性。具体操作：样品用丙酮配成2.5 mg/mL药液，将药液(对照用丙酮代替)与温度为50～55 ℃的PDA培养基按1∶9混合均匀后，倒入直径为9 cm的培养皿内，冷凝制成带毒培养基后，每皿分别接种3块已活化好的直径为4 mm的供试病原菌菌饼(甘蔗凤梨病菌每皿接1块)，带菌丝面朝下贴至培养基表面。每处理3次重复，于28 ℃恒温培养箱中培养72 h，采用十字交叉法测量菌落生长直径，取平均值，计算抑菌率：抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.4 cm)×100%。测定对植物病原菌菌丝体的有效中浓度(EC50)时，根据初筛时的抑菌率，配制系列不同浓度的药液，测定其对供试病原真菌的菌丝毒力，用最小二乘法求出毒力回归方程、EC50等。

1.8 抗动物病原细菌活性测定

先采用滤纸片法进行抗细菌活性初筛，再以带毒平板法测定活性样品的最低抑制浓度(MIC)。

滤纸片法：参考林洋等[25]的滤纸片法进行抗细菌活性初筛，具体操作：将热熔的牛肉膏蛋白胨培养基倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，冷凝备用。用西林瓶制备供试病原细菌悬液，从培养24 h的细菌培养基中用接种环刮取适量细菌与无菌水进行充分混匀，再用移液枪吸取0.1 mL菌液加至培养基表面，用涂布棒涂布均匀，制成表面含菌培养基。样品用丙酮溶解并配成10.0 mg/mL药液，将直径为6 mm完好的滤纸片浸入药液(对照以丙酮代替)5 min，取出晾干。将滤纸片贴入平板内适当位置，小心用镊子压平，使整个圆形滤纸片与培养基表面贴合，放入37 ℃细菌恒温培养箱中培养24 h，用十字交叉法测抑菌圈直径。根据抑菌圈大小，将抑菌效果分为如下几类：抑菌圈直径为0 mm者为不敏感；小于10 mm者为轻度敏感；10～15 mm者为中度敏感；大于15 mm者为高度敏感[26]。

MIC值测定：参考DENG等[21]的方法测定样品MIC值。用丙酮将样品溶解并配成系列浓度药液，将药液(对照用丙酮代替)与温度为50～55 ℃的热溶牛肉膏蛋白胨培养基按1∶9混合均匀后，倒入直径为6 cm的培养皿(5 mL/皿)，待凝固后，吸取50 μL菌悬液至培养基表面，用涂布棒涂布均匀。每处理重复3次，于(37±1)℃恒温倒置培养24 h，观察细菌的生长情况。

1.9 数据处理

2 结果与分析

2.1 血散薯内生真菌的分离与鉴定

从血散薯茎、叶组织共分离得到38株内生真菌，其中31株基于ITS序列的BLAST比对结果(表1)，结合形态学特征，将其归为14个属：链格孢属(Alternaria)、炭团菌属 (Hypoxylon)、枝孢属(Cladosporium)、茎点霉属(Phoma)、镰刀属(Fusarium)、Stagonosporopsis、Ascomycete、毛壳菌属(Chaetomium)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、弯孢霉属(Curvularia)、短梗霉属(Aureobasidium)、Annulohypoxylon、小光壳属(Leptosphaerulina)、刺盘孢属(Colletotrichum)。鉴定结果表明，31株内生真菌中链格孢属和茎点霉属为优势属，在茎、叶组织中均有分布。其中，链格孢属13株，茎点霉属4株，表明其可能是血散薯茎、叶中稳定存在的内生真菌。其次为弯孢霉属和镰刀属，各2株，其余10个属的内生真菌均仅分离得到1株。

表1 31株血散薯内生真菌ITS序列BLAST比对结果Tab.1 ITS sequences BLAST alignment results of 31 endophytic fungi of Stephania dielsiana

续表1 31株血散薯内生真菌ITS序列BLAST比对结果Tab.1(Continued) ITS sequences BLAST alignment results of 31 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu

2.2 血散薯内生真菌对9种植物病原真菌的抗菌活性

基于对峙拮抗预试验结果，从上述38株内生真菌中选取表1中的13株及未测序的YB-20，共14株真菌进行发酵培养，并进一步测定发酵产物抗植物病原真菌活性，结果如表2所示。在药液质量浓度为2.5 mg/mL时，14株内生真菌发酵产物的粗提物对9种植物病原真菌具有不同程度的抑制作用。除内生真菌J-26、Y-64外，其余内生真菌的粗提物均至少对1种供试植物病原真菌的抑菌率达到50%以上。其中，Y-66对9种植物病原真菌的抑菌率均在55%以上，抑菌率介于56.81%～100.00%，表现出较为广谱的抗菌活性。内生真菌叶-8和J-12对除了茶轮斑病菌以外的8种供试植物病原真菌的抑菌率均在50%以上。其中，叶-8对金橘砂皮病菌抑菌率为88.56%，J-12对烟草黑胫病菌抑菌率则达到100.00%。YB-12对除了辣椒炭疽病菌和茶轮斑病菌外的7株供试植物病原真菌的抑菌率均在60%以上，对甘蔗凤梨病菌、水稻胡麻叶病菌及烟草黑胫病菌的抑制作用最佳，抑菌率均为100.00%。内生真菌J-34、J-36和J-55均对其中5株供试植物病原真菌的抑菌率在60%以上。上述结果表明，血散薯内生真菌具有较好的抗植物病原真菌活性，其中7株内生真菌(叶-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36、J-55)的抗菌活性较为明显和广谱。

表2 14株血散薯内生真菌发酵产物粗提物对9种植物病原真菌的抑制作用Tab.2 Antifungal activity of the extracts of 14 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu against 9 plant pathogenic fungi %

2.3 血散薯内生真菌对9种植物病原真菌菌丝的毒力

为确定以上7株活性菌株(叶-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36、J-55)的抗真菌活性，结合以上抗菌活性测定结果，选取该7株活性内生真菌发酵产物粗提物对植物病原真菌抑菌率达到50%以上的相应病原菌作为供试菌株，进一步测定其对供试菌株菌丝的毒力，结果见表3。叶-8粗提物对玉米大斑病菌、甘蔗凤梨病菌、贡柑链格孢菌、金橘沙皮病菌、烟草黑胫病菌具有较好的毒力，EC50值介于0.048 0～0.363 5 mg/mL，均小于0.5 mg/mL，其中，对玉米大斑病菌、甘蔗凤梨病菌、金橘砂皮病菌具有较好的抗菌活性，其EC50值分别为0.063 1、0.059 5、0.048 0 mg/mL，均小于0.1 mg/mL。Y-66粗提物对其中6株供试植物病原真菌的EC50值介于0.133 3～0.679 0 mg/mL，其中，对甘蔗凤梨病菌具有最好的抗菌活性，EC50值为0.133 3 mg/mL。J-12粗提物对其中5株供试植物病原真菌的EC50值介于0.006 2～0.700 3 mg/mL，其中，对金橘砂皮病菌具有最好的抗菌活性，EC50值为0.006 2 mg/mL。YB-12粗提物对其中6种供试植物病原真菌的EC50值小于1.0 mg/mL，介于0.115 7～0.615 4 mg/mL，其中，对甘蔗凤梨病菌具有最好的抗菌活性，EC50值为0.115 7 mg/mL。J-34粗提物对供试的5株植物病原真菌的EC50值介于0.004 2～0.522 6 mg/mL，其中，对甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、贡柑链格孢菌均具有极好的抗菌活性，EC50值分别为0.018 1、0.004 2、0.084 6 mg/mL。J-36粗提物对玉米大斑病菌、贡柑链格孢菌的抗菌活性较好，EC50值分别为0.964 9、0.709 0 mg/mL。J-55粗提物对其中3种植物病原菌的EC50值小于1.0 mg/mL，其中，对甘蓝黑斑病菌具有最好的抗菌活性，EC50值为0.280 8 mg/mL。

表3 7株血散薯内生真菌发酵产物粗提物对植物病原真菌菌丝的毒力Tab.3 Toxicity of the extracts of 7 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu to mycelium of plant pathogenic fungi

2.4 血散薯内生真菌对2种动物病原细菌的抗菌活性

采用滤纸片法对2.2中14株内生真菌发酵产物粗提物的抗动物病原细菌活性进行初筛，发现该14株内生真菌具有一定抗菌活性。为进一步确定其抗菌作用，采用带毒培养基法测定其抗菌活性。当药液质量浓度为10.0 mg/mL时，有10株内生真菌对至少1种动物病原细菌具有抗菌活性(表4)。进一步测定其MIC值，发现10株内生真菌对金黄色葡萄球菌的MIC值介于0.500～10.000 mg/mL，其中，YB-25对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最好，MIC值为0.500 mg/mL。仅有4株内生真菌(叶-8、YB-20、J-12、J-17)对大肠杆菌具有抗菌活性，MIC值介于0.156～4.000 mg/mL，其中，J-12对大肠杆菌的抗菌活性最佳，MIC值为0.156 mg/mL。叶-8、YB-20、J-12、J-17对2种供试动物病原细菌具有较好抑制作用。总体来看，内生真菌J-12发酵产物粗提物对10种动物病原细菌中的2种(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)抑制作用相对较好(MIC值分别为1.250、0.156 mg/mL)，明显高于已报道的血散薯甲醇提取物对2种供试动物病原菌的抗菌活性(MIC值分别为3.75、7.50 g/L)，并高于Stephanine和Crebanine对大肠杆菌的抗菌活性(MIC值均大于5 g/L)[21]。

表4 10株血散薯内生真菌发酵产物粗提物抗动物病原细菌的活性Tab.4 Antibacterial activities of the extracts of 10 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu against animal pathogenic bacteria

注：---表示未长菌；+++表示长菌；/表示无抗菌活性。

Notes: --- indicates no bacteria; +++ indicates expressing bacteria; /indicates no antibacterial activities.

3 结论与讨论

本研究首次报道了血散薯内生真菌的分离鉴定及其抗菌活性。从血散薯茎叶中共分离得到38株内生真菌，其中31株已通过形态学结合分子生物学的方法鉴定，将其归为14个属。其中，优势属为链格孢属和茎点霉属，在茎、叶组织中均有分布，表明其可能是血散薯茎叶中稳定存在的内生真菌。链格孢属和茎点霉属在已报道的许多植物内生真菌中也均为优势属[22,27-28]，可见链格孢属和茎点霉属是植物中普遍存在的内生真菌。

经内生真菌发酵产物粗提物抗菌活性研究发现，分离得到的大部分血散薯内生真菌具有良好而广谱的抗菌活性。其中，抗植物病原真菌活性的研究结果表明，7株内生真菌(叶-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36和J-55)均具有较为明显和广谱的抗植物病原真菌活性。而在抗动物病原细菌方面的研究结果表明，10株供试内生真菌的发酵产物粗提物对金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性，但仅有4株内生真菌对大肠杆菌表现出抗菌活性。以上结果与前人[21]报道的血散薯植物抗菌活性相似，即血散薯甲醇粗提物及其活性成分Stephanine和Crebanine对植物病原真菌具有明显而广谱的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌均具有不同程度的抑制作用，而对大肠杆菌的抗菌活性较差。

本研究结果表明，血散薯茎、叶组织中存在丰富的内生真菌资源，且其次生代谢产物含有广谱抗菌活性物质。后期可对其活性物质进行分离和鉴定，以寻找活性化合物等，为生物源杀菌剂的创制提供更多优秀的先导化合物，同时也将为活性天然产物提供重要的资源，并对其在农业及医药领域的应用具有重要意义。