牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

刘长彬，石国庆，卢春霞

(1. 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003; 2. 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院，新疆石河子 832000;3. 长江师范学院 现代农业与生物工程学院，重庆 408100)

0 引 言

【研究意义】妊娠相关糖蛋白 ( Pregnancy-associated glycoproteins，PAG) 是偶蹄类动物胎儿胎盘滋养层细胞合成、分泌的一类糖蛋白。1991年Zoli 等[1]在从奶牛胎盘中分离出得到分子量为67 kDa的糖蛋白，与Butler等[2]发现的妊娠特异性蛋白 B ( PSPB )有着高度的相似性，构成了一个庞大的胎盘糖蛋白家族，统称PAG。PAG属于天冬氨酸蛋白酶家族，与胃蛋白酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸序列，但大多数PAG由于催化位点氨基酸发生置换使得其没有酶活性。牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)基因家族至少有 22 个转录本以及变异体，由胎盘滋养外胚层细胞和滋养外胚层的双核细胞表达产生，有些在胚胎附植后进入母体血液[3-5]，且整个孕期持续存在，常作为一种标志物用于母畜早期妊娠诊断[6-8]。【前人研究进展】基于免疫分析的商品化PAG检测试剂盒已大规模推广应用，并取得较高的诊断准确率[9-10]，但进口试剂盒检测成本过高(36元/头)，大多数牛场望而却步。而国内关于PAG相关研究报道较少，且无商品化的PAG蛋白和抗体销售，进而限制了其在国内牧场的推广应用。因此，获取高纯度PAG蛋白，建立相应的快速检测方法，是需要迫切解决的问题。目前，已有研究者从多种哺乳动物胎盘胎儿子叶中分离出PAG 天然蛋白[1, 11-12]，但是纯化步骤繁琐复杂，需要多种纯化方法同时使用才能获得高纯度的PAG。也有人利用豌豆凝集素[13-14]及胃蛋白酶抑制剂[15-16]等特异性结合PAG，通过亲和层析法分离获得PAG，但该法成本较高，不利于蛋白的大量纯化。而体外重组蛋白技术为PAG结构、功能和应用研究提供了新思路，目前已有人在真核系统中表达了bPAG1[17]，但PAG1 在体内的半衰期较长，在母畜产后80～100 d内仍能检测到，在此时间段内检测易出现假阳性结果[6, 18]。有研究表明，bPAG9早在牛妊娠后 25 d 就已经表达[3]，且在前3个月内转录水平显著高于bPAG1[19]。【本研究切入点】迄今为止，尚未见到关于bPAG9重组蛋白的研究报道。研究据宿主细胞对密码子的偏好性，对bPAG9基因密码子进行优化。【拟解决的关键问题】通过PCR方法扩增得到bPAG9的全基因序列，然后构建proEM-bPAG9真核表达载体，在HEK293细胞中诱导表达并产生bPAG9重组蛋白。研究天然bPAG蛋白不易分离纯化，为奶牛早期妊娠诊断产品的研发提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试剂

DH5a菌株、ProEM载体、Ni-IDA 蛋白纯化试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自德泰生物科技(南京)有限公司；、T4 DNA 连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；SDS-PAGR变性丙烯酰胺凝胶制备试剂盒、小鼠抗6× His单克隆抗体、蛋白Mark、DNA mark、EcoRI 内切酶 、HindIII 内切酶、丙烯酰胺、脂质体高效转染试剂、氨苄青霉素等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。质粒抽提试剂盒、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司；ToxinEraserTM 内毒素去除试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨购自OXOID公司；二甲基亚砜(DMSO)、L-谷氨酰胺购自Sigma公司；哺乳动物细胞培养基 、Opti-MEM、Anti-Clumping-Agent 、Pluronic®F-68等购自Gibco Thermo Fisher公司。

1.1.2 仪器与设备

VeritiTM96梯度PCR仪(美国ABI)；Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国BIO-RAD)；Essential V4凝胶成像系统(英国UVITEC)；Powerpac 300电泳仪(美国BIO-RAD)；DYCZ-24EN双垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；DYCP-31BN琼脂糖水平电泳(北京六一仪器厂)；Thermo311 CO2培养箱(美国热电公司)；Thermo ScientificTMVarioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(美国赛默飞)；KTA Explorer 100 蛋白纯化层析系统(美国通用电气(GE)公司)；倒置生物显微镜(上海测维光电技术有限公司)；MicroPulser电转仪(美国Bio-Rad)；BSC -150 型恒温恒湿培养箱( 上海博讯事业有限公司)；优普超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司)；生物安全柜(苏静安泰)。

1.2 方 法

1.2.1 bPAG1基因优化与合成

根据根据 Genbank公布的bPAG9(登录号：AF020511.1)核苷酸序列，以及宿主细胞的对密码子的偏好性，对bPAG9密码子进行优化，并在优化后序列的5’端设计EcoRI位点，3’端设计HindIII酶切位点和His-Flag 标签，优化的序列见3.1。根据优化后的bPAG9核苷酸序列，应用 primer premier软件设计18条引物(其余引物未列出)，引物1：5’- CCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCCCGCCGCCACCATGAAGTGGATCGTGCTCCTGGGCCTGGTGGCTTTCAGCGAGTG-3’，引物18：5’-GCCGGCCTCGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTATCAGTGGTGGTGATGATGGTGCACGGCTCTAGCCAGTCCGATTCTGTCGTTGCCCCGGT-3’(下划线分别分为EcoRI和HindIII酶切位点)，然后通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物，bPAG9基因优化及合成由德泰生物科技(南京)有限公司完成。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，用 DNA 凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.2 重组载体ProEM-bPAG9的构建

将回收的PCR产物和ProEM载体用EcoRI和HindIII进行双酶切。PCR产物酶切体系：纯化回收的PAG9片段20 μL，10×FD Buffer 5 μL，EcoRI 2.5 μL (10U/μL)，HindIII 2.5 μL (10U/μL)，ddH2O加至50 μL。ProEM 载体酶切体系：ProEM 载体5 μL，10× FD Buffer 5 μL，EcoRI 2.5 μL (10U/μL)，HindIII 2.5 μL (10U/μL)，ddH2O 加至50 μL，以上体系分别37℃酶切1 h。以上酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒回收。将回收的酶切产物用T4连接酶在22℃连接2 h。连接体系为：PAG9 DNA 4 μL，线性载体3.5 μL，T4DNA连接酶Z〗 1 μL (5U/μL)，10x T4buffer 2 μL，ddH2O 加至20 μL。

1.2.3 ProEM-bPAG9载体转化、筛选与鉴定

将10 μL连接产物加入到50 μL的DH5a感受态细胞中，混匀，冰浴 10 min。42℃热激 45 s，冰浴 5 min。加入LB液体培养基中，37℃ 摇菌培养30 min。取20 μL菌涂到Amp+/LB 固体培养基平板上，37℃过夜培养。挑取单个菌落接种到LB液体培养基中，37℃培养8 h，然后再按1/500比例接种于200 mL LB培养基中，37℃培养16 h。收集菌液，离心、去上清。采用质粒抽提试剂盒提取质粒，以其为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：引物1 0.5μL，引物18 0.5 μL，提取质粒 2 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL (10U/μL) ，10× PCR buffer 10 μL，dNTP 1 μL (10 mM)，ddH2O补齐至50 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min， 95℃变性25 s，62℃退火20 s，72℃延伸40 s，共25个循环，72℃延伸1 min，4℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并对提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切体系和条件同ProEM载体。将PCR鉴定与双酶切鉴定得到的阳性转化子送德泰生物科技(南京)有限公司测序，经测序验证插入序列正确无误后，进行质粒大量抽提，保存至-20℃备用。

1.2.4 重组质粒ProEM -bPAG9的诱导表达

rbPAG9的诱导表达参考Patel的方法[17]，并稍作修改。将HEK293细胞37℃复苏，转移至10 mL培养基中，800 r/min离心5 min，去上清，重悬细胞，转移到培养瓶中，加入新鲜培养基，使其密度达到3×105～4×105cells/mL，活力>95%。然后置于培养箱中37℃、5%CO2培养2～3 d，密度达到2.0×106cells/mL时进行传代。转染前1 d将HEK293细胞悬浮培养，使其接种密度达到1×106cells/mL，将重组质粒取和转染试剂加入至转染缓冲液中，混匀后加入到待转染细胞中，37℃、5% CO2培养4 d，收集细胞培养物，离心，收集上清或细胞。

1.2.5 重组蛋白的纯化

收集培养液上清，过0.22 μm滤膜后，上清液在4℃下透析(缓冲液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0)，然后采用Ni-IDA柱纯化目的蛋白，采用含不同浓度的咪唑(50、500 mM)洗脱溶液进行梯度洗脱，将上清液、流穿液、洗脱液进行 SDS-PAGE电泳，通过考马斯亮蓝染色检测纯化效果。传化后的目的蛋白采用BCA试剂盒测其浓度。

1.2.6 重组蛋白的Western blot鉴定

2 结果与分析

2.1 bPAG-9基因 PCR扩增与鉴定

Genbank公布(登录号：AF020511.1)的bPAG9基因全长为1 311 bp，蛋白编码区(coding sequence, CDS)长度为1 140 bp，根据宿主细胞对密码子的偏好性，加入酶切位点及保护碱基等，优化后的bPAG-9基因序列全长1182 bp，基因序列如下：5’-GAATTCCCGCCGCCACC

ATGAAGTGGA TCGTGCTCCT GGGCCTGGTG GCTTTCAGCG AGTGCATCGT

GAAGATCCCC CTGAGGCAGG TCAAGACCAT GCGGAAGACC CTGAGCGGCA

AGAACATGCT GAAGAACTTC CTGAAGGAGC ACCCCTACAG ACTGAGCCAG

ATCAGCTTCC GGGGCAGCAA TCTGACCATC CACCCCCTGC GGAACATCAT

GAACCTGGTG TACGTGGGCA ACATCACCAT CGGCACCCCT CCTCAGGAGT

TCCAGGTGGT GTTCGACACC GGAAGCAGCG ATCTCTGGGT GCCCAGCTTT

袁安回过头，红着眼睛看着他的小伙伴们：“我们继续往前走，哪怕是一条龙守在那里，我也要举着火把往它的嘴巴里走，走过它的咽喉，它的胃，它的肠子，再黑也不会怕。我相信万花谷，它需要我们，就像我们需要它。现在它就在山洞之外。”

TGCACCATGC CAGCTTGTAG CGCTCCAGTG TGGTTCAGGC AGCTGCAGAG

CAGCACCTTC CAGCCCACCA ACAAGACCTT CACCATCACC TACGGCAGCG

GCTCTATGAA GGGCTTCCTG GCCTACGACA CCGTGAGAAT CGGCGATCTG

GTGTCCACCG ATCAGCCTTT TGGCCTGAGC GTGGTGGAGT ACGGACTGGA

GGGAAGGAAC TACGACGGAG TGCTGGGCCT GAACTACCCT AACATCAGCT

TCAGCGGCGC CATCCCCATC TTCGACAACC TGAAGAACCA GGGCGCCATC

AGCGAGCCAG TGTTCGCCTT CTACCTGAGC AAGAACAAGC AGGAGGGCAG

CGTCGTGATG TTCGGAGGCG TGGACCACCA GTACTACAAG GGCGAGCTGA

ATTGGATCCC CCTGATCGAG GCAGGCGAGT GGAGAGTGCA TATGGACAGG

ATCAGCATGA AGCGGACCGT GATCGCTTGC TCTGACGGTT GCGAGGCTCT

GGTGCACACA GGAACAAGCC ACATTGAGGG CCCAGGCAGA CTGGTGAACA

ACATCCACCG GCTGATCAGG ACCAGGCCCT TCGACAGCAA GCACTACGTG

TCTTGCTTCG CCACCAAGTA CCTGCCCAGC ATCACCTTCA TCATCAACGG

CATCAAGTAC CCCATGACCG CCAGGGCCTA CATCTTCAAG GACAGCAGAG

GCAGGTGCTA CAGCGCTTTC AAGGAGAACA CCGTGCGGAC CAGCAGAGAG

ACTTGGATCC TGGGAGACGC CTTCCTGAGG CGCTATTTCA GCGTGTTCGA

CCGGGGCAAC GACAGAATCG GACTGGCTAG AGCCGTGCACCATCATCACCACCAC

TGATAAGCTT- 3’。

下划线分别分为EcoRI 和HindIII酶切位点，5’端斜体为保护碱基序列，3’端斜体为His-Flag标签位点。图1电泳结果表明，PCR成功扩增出带有酶切位点的目的基因bPAG9，片段大小约1 182 bp，与理论大小基本相符。 图1

图1 bPAG9优化后全基因PCR扩增电泳图
Fig. 1 The electropherogram of PCR products of bPAG9 gene

2.2 重组质粒ProEM-bPAG9的构建及鉴定

重组载体转化后，随机挑选2个单菌落进行PCR 鉴定，电泳结果显示(图2a)，泳道 1～2出现与预期大小相同的目的条带，表明重组质粒成功转化到感受态细胞DH5a。对重组质粒进行双酶切(图2b)，泳道1为重组质粒(5 545 bp)，从上至下分别为重组质粒的环状、线性和超螺旋三种状态，泳道2在为酶切后的ProEM载体和bPAG9基因 ，酶切后的长度分别为4 369 bp和1 176 bp，与预期结果相符，且酶切条带单一，表明重组载体构建成功。将测序结果与优化后的bPAG9基因对比分析，碱基序列完全一致，符合率为100%，其编码的氨基酸与Genbank (protein ID：AAC04682.1) 公布的完全一致，表明bPAG9插入片段完全正确，未发生任何碱基突变。图2

2.3 重组蛋白的表达纯化

重组表达载体上带有6× His标签，将诱导表达的HEK293细胞上清经Ni-IDA纯化试剂盒进行亲和层析，随后利用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行检测，结果显示(图3)，500 mM的咪唑洗脱溶液可获得纯度较高的bPAG9重组蛋白，其相对分子质量约68 kDa，与天然蛋白分子量基本一致[1]。纯化后的rbPAG9经SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer灰度分析(图4a～b)， rbPAG9纯度达90%。经BCA方法检测，rbPAG9的OD562值为0.273，代入标准曲线 (图5)，纯化rbPAG9浓度为 0.134 mg/mL。图3～5

a: M, DNA Marker; 1-2, 阳性克隆. b: M, DNA Marker; 1, 重组质粒; 2, 双酶切片段

a: M, DNA Marker; 1-2; cloning products. b: M,DNA Marker; 1, recombinant plasmid; 2, enzymatic digestion fragment

图2 阳性克隆(a)及重组质粒双酶切(b)鉴定结果
Fig. 2 Identification of cloning products (a) and recombinant plasmid (b) by enzymatic digestion

2.4 重组蛋白的Western blot鉴定

纯化的rbPAG9重组蛋白C 端包含一个His 标签，根据这一特性，利用 His标签抗体对bPAG9重组蛋白进行Western blot检测。在约 68 kDa 处有特异性杂交条带(图6)，与SDS-PAGE结果一致，说明该重组蛋白在真核表达系统中诱导表达成功。图6

M：蛋白质分子质量标准，1：上清液，2：流出液，3～5：50 mM咪唑洗脱组分，6～7：500 mM咪唑洗脱组分，泳道上样量10 μL

M: Protein Marker, 1: Supernate, 2: Effluent, 3-5: Eluent of 50 mM imidazole, 6-7: Eluent of 500 mM imidazole, sampling amount: 10 μL

图3 SDS-PAGE分析rbPAG9纯化效果
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of rbPAG9

M：蛋白Marker；1：BSA (1.0 μg)；2：bPAG9 重组蛋白 (0.5 μg)

M: Protein Marker; 1: BSA (1.0 μg), 2: rbPAG9 (0.5 μg)

图4 SDS-PAGE(a)和Gel-Pro Analyzer灰度分析(b)rbPAG9纯度
Fig. 4 The purity analysis of rbPAG9 by SDS-PAGE (a) and Gel-Pro Analyzer (b)

3 讨 论

牛妊娠相关糖蛋白 (bPAG) 种类繁多，人们利用RT-PCR技术从牛胎盘组织中筛选出了至少22种 PAG cDNA转录本，根据其出现的时间，将其分为两组：“古代组”与“现代组”，“古代组”PAG出现在8 000万年前，经过进化在约5 000万年前出现“现代组”PAG[4]。 大多数 bPAG如bPAG-1、3、4、5、6、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22属于“现代组”，由胎盘滋养外胚层的双核细胞表达产生，由于催化中心碱基发生了突变而不具有酶活性；而bPAG-2、8、10、11、12、13基因属于“古代组”，在整个滋养外胚层细胞中产生，保留了典型天冬氨酸肽酶的所有特征，具有酶活性[3, 5, 20]。由于bPAG家庭成员间的序列差异，bPAG基因在整个妊娠期的表达和分泌呈现时空特异性[3, 5, 19-21]，如Green运用核糖核酸酶保护实验检测胎盘中RNA的表达，发现bPAG-2、4、5、8、9、10、11 早在妊娠后 25 d 就已经表达，而bPAG-1、6、7在妊娠后 45 d开始表达，主要存在于妊娠中后期[3]。其中，bPAG9在妊娠前三个月内表达水平显著高于bPAG1[19]。因此，bPAG9可作为一个更理想的标志物用于牛早期妊娠诊断。

图5 BCA方法标准曲线
Fig. 5 The standard curve of BCA method

由于bPAGs 蛋白种类繁多，增加了对其结构和功能研究的难度，体外重组蛋白的出现为探究一类蛋白的结构和功能提供了新思路。研究采用基因优化和PCR体外扩增获得bPAG9目的基因，并将其成功插入到真核表达载体proEM中，采用HEK293细胞经瞬时表达得到相对分子质量约68 k Da的重组蛋白。bPAG9原始基因CDS长度为1 140 bp，包含9个外显子和8个内含子，编码379个氨基酸残基(amino acid, AA)，信号肽别区域位于第1～15位氨基酸残基，蛋白质理论分子量为 42.856 kDa，等电点8.82。而天然的bPAG蛋白分子量约为67 kDa[1, 22]。研究所得bPAG9重组蛋白的表观分子质量与天然蛋白基本一致，但大于bPAG9蛋白的理论分子量，可能rbPAG9在真核表达过程中存在糖基化修饰，因为有研究表明bPAG的氨基酸序列存在N-糖基化位点，导致其在翻译修饰后分子量增加[23]。

M：蛋白质分子质量标准，1：纯化后的rbPAG9(0.5μg)

M: Protein Marker, 1 : Purified rbPAG9 (0.5μg)

图6 rbPAG9的 Western blot鉴定
Fig. 6 Western blotting analysis of rbPAG9

4 结 论

研究通过基因优化和PCR法扩增得到全长1 182 bp的bPAG9全基因序列，以ProEM为真核表达载体成功构建了重组质粒ProEM-bPAG9，双酶切后获得与预期值相符的两条片段(4 369 bp和1 176 bp)，将重组质粒转入HEK293细胞进行瞬时表达，经过Ni柱亲和层析，在含有500 mM的咪唑溶液条件下洗脱，获得相对分子质量约为68 kDa的bPAG9重组蛋白，rbPAG9纯度可达90%。研究获得的bPAG9重组蛋白为其单克隆抗体的制备和奶牛早期妊娠诊断产品的研发奠定了基础。