茶叶中花青素测定方法研究进展及分光光度测定法的优化

2019-10-21王静王瑾徐建峰郑国建周卫龙

中国茶叶加工 2019年3期

王静，王瑾，徐建峰，郑国建，周卫龙 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.国家茶叶质量监督检验中心，浙江杭州 310016）

花青素是一种广泛存在的天然植物水溶性色素，属于黄酮类化合物。大量研究表明花青素具有诸多生物学功效，例如抗氧化[1-2]、抗病毒[3]、预防心血管疾病[4-5]、抗衰老[6]等。茶叶中也富含花青素，红紫色茶树叶片在夏季高温条件下，易在高海拔的群体茶园中发生，是一种茶树抗逆生理的表现形式[7]。有研究表明，茶叶中的花青素具有苦味，影响茶叶品质，因此过去富含花青素的紫芽茶品质欠佳也较少有人关注[8]。一般茶叶中的花青素含量只占干物质的0.01%左右[9]，紫色芽叶中的花青素含量则可高达0.5%～1.0%[10]。云南省农业科学院茶叶研究所采用单株选种法经多代培育出的新品“紫娟”（品种权号 20050031），具有紫芽、紫叶、紫茎的特性，并且其花青素的含量是一般红芽茶的3倍左右[11]。由于紫芽茶中花青素含量较高具有一定的特征性，茶叶中花青素含量的高低可以作为一种评判紫芽茶的依据。

近年来由于对花青素生物功能的深入研究，消费者对于在自然界中含量丰富的水溶性色素的关注度随之上升。目前由肯尼亚提出，国际标准化组织食品技术委员会茶叶分技术委员会（ISO/TC34/SC8）已同意紫芽茶作为前期项目立项，项目名称为ISO/PWI 23827《紫芽茶定义和基本要求》。因此建立一种操作简便、可操作性强的茶叶中花青素含量的检测方法显得尤为重要。

目前关于茶叶花青素的研究主要集中在茶树选育开发[12-13]、合成途径及调控机理[14]等，对于花青素的检测方法研究较少。植物源性食品中花青素含量主要的检测方法有pH示差法、分光光度法和液相色谱法三种。文章对目前茶叶及其他植源性食品中花青素的主要检测方法进行综述，并结合自身研究，对今后茶叶中花青素的检测方法提出一定的建议及数据支持。

1 花青素的理化特性

花青素的基本结构单元是2-苯基苯并吡喃型阳离子，即花色基元。在植物中常见的花色基元主要有天竺葵色素（Pelargonidin）、矢车菊色素（Cyanidin）、飞燕草色素（Delphindin）、芍药色素（Peonidin）、牵牛花色素（Petunidin）及锦葵色素（Malvidin）[15]，其基本结构和花色基元结构分别如图1和表1所示。

图1 花青素的基本结构[16]Fig.1 Basic structure of anthocyanins

表1 常见花色基元结构[16]Table 1 Chemical structure of common anthocyanins

自然条件下游离状态的花青素极少见，一般均以糖苷的形式存在，常与一个或多个葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等通过糖苷键形成花色苷[15，17]。目前，在植物中分离鉴定的花青素种类超过600多种，植物中新的花色苷种类的分离鉴定还在增加[18]。

根据不同的pH和螯合物中金属离子，花青素所呈现的颜色也不同：pH＜7呈红色，pH在7～8时呈紫色，pH＞11时呈蓝色。茶叶细胞液呈酸性，因此当茶叶中的花青素含量较高时会呈现红紫色。植源性食品中的花青素易溶于水和醇类化合物，在pH小于3的酸性条件下较为稳定[19]。

2 茶叶中花青素的测定方法

2.1 pH示差法

pH示差法的原理为花色苷发色团的结构转换是pH的函数，而对花色苷起干扰作用物质的性质却不随pH值变化。在花色苷最大吸收波长下确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，对花色苷进行定量分析。

赵慧芳等[20]使用pH示差法测定黑莓果实中花色苷的含量，利用花色苷及黄酮在pH为1.0时在510 nm及700nm处均有最大吸收，而pH为4.5时仅在700 nm处有最大吸收的特点，用示差法测定花色苷总量（其总量以矢车菊-3-葡萄糖苷计）。殷海松等[21]参考该方法对蓝莓中的花色苷进行了测定。宋德群等[22]在520 nm下，分别测定pH1.0和pH4.5时吸光度，测定蓝莓中的花色苷含量（以矢车菊-3-葡萄糖苷计）。其测定结果的相对标准偏差为1.39%，并且认为该种方法受到其他干扰物的影响较小。张荣菲等[23]参考上述方法进行蓝莓中花青素的测定。

pH示差法目前也在茶叶中花青素检测方面有所应用。田野等[24]使用pH示差法测定了“紫嫣”茶中花青素的含量，其结果为2.29 mg/g。陈琼等[25]对比了单一pH法及pH示差法分别测定茶树芽叶中花色苷的含量，认为单一pH法的结果与pH示差法存在很大的相关性（R2＝0.9927），且单一pH法结果偏高，但文中pH示差法的结果较以往文献结果[2，10]偏低。

pH示差法操作较为简便，较常见于植源性食品中花色苷的测定，但受两个不同pH值下两种花色苷存在形态的平衡转化率的影响[25]，其测定结果存在偏低的现象。

2.2 液相色谱法

目前植源性食品中花青素的测定较常见使用液相色谱法。陈长应[26]使用液相色谱测定了黑绿豆中花青素的含量，其使用原花青素作为标准品制作标准曲线进行测定，结果重复性和回收率均较好。赵子丹等[27]使用液相色谱测定黑果枸杞中的花青素含量，其使用了六种常见花青素（矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素）标准品进行测定，且结果精密度好、准确度高。

使用液相色谱法对茶叶中的花青素进行测定的文献报道也较多。李智[28]建立了一种茶树紫色芽叶花色苷的HPLC分析方法，运用HPLCDAD-MS/MS联用技术，初步推测了茶树紫色芽叶花青素中5个主要组分，分别为飞燕草-3-半乳糖苷、矢车菊-3-半乳糖苷、飞燕草-3-芸香糖苷、矢车菊-3-芸香糖苷和天竺葵-3-芸香糖苷。吕海鹏等[29]使用HPLC法测定“紫娟”茶树品种的花青素组分及其含量，认为“紫娟”茶的花青素主要成分为4种花青素单体，分别为天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊-3-O-半乳糖苷、天竺葵色素和锦葵色素，测定结果这四种花青素单体总和为0.43 mg/g。解东超等[30]使用液相色谱串联质谱的方法在紫娟烘青绿茶中鉴定出12种花青素并定量，最终测定的紫娟烘青绿茶成品茶中的花青素总量为1.82 mg/g。在标准方法方面，农业部发布了相关行业标准NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》[31]，其中使用6种花青素标准品作为标品分别对花青素进行定量。

液相色谱法虽然是目前较为简便快捷的一种花青素的检测方法，但自然存在的花青素种类繁杂、品种众多，利用高效液相色谱法直接分析需要购置多种标准品，成本较高，用于实际检测仍然存在一定难度[27]。并且使用液相色谱法对紫色芽叶品种的花青素进行的测定结果[29-30]与之前普遍认为的紫色芽叶品种中花青素含量（0.5%～1.0%）[2，10，29]相比普遍偏低。

2.3 分光光度法

分光光度法是较为常用的测定植源性食品中花青素的一种方法。陈长应[32]建立了一种微波消解-可见分光光度法测定紫甘薯中花青素的测定方法，使用原花青素作为标准品进行定量测定，结果表明该方法简便准确。刘长姣等[33]使用分光光度法对黑米中的花青素进行测定，使用矢车菊素-3-葡萄糖苷作为标准品进行定量，结果表明方法操作简便、重复性好、测定结果精密度高。

使用分光光度法对茶叶中花青素的测定的文献报道较少。钟萝[34]在《茶叶品质理化分析》中提到测定茶叶中总花青素含量的分光光度法。茶叶磨碎后经沸水提取，使用酸性乙醇溶液显色后进行比色定量。该种分光光度法操作简便，无需使用多种标准品，可大幅度降低检测成本，因此可操作性强，适用于茶叶中花青素含量的测定。

3 茶叶中总花青素分光光度测定法的改进

使用分光光度法测定茶叶中总花青素[34]时，由于茶叶提取液本身在花青素吸收波长下也存在一定的吸光度，会引起测定结果偏高，因此在最后结果计算时应扣除相应的样品空白。

对该方法改进后具体操作步骤如下：称取磨碎茶样2.0 g，加沸水 10 mL，在沸水浴中提取30 min，过滤后加水定容至50 mL。准确吸取2 mL提取液置于试管中，加酸性乙醇溶液5 mL，摇匀。静置30 min后于535 nm波长下比色，以试剂空白作参比，同时吸取2 mL提取液加入5 mL蒸馏水作为样品空白，在最后结果计算中扣除。

根据上述方法，对市售绿茶、红茶和由紫芽茶加工的几种成品茶进行测定，结果如表2所示。

表2 几种茶叶中花青素测定结果Table 2 Contents of total anthocyanins in tea samples

从表2中可以看出，一般茶叶中花青素含量较低，加入酸性乙醇溶液后不会显出明显刚果红色，且样品空白值会略高于样品测定值。而紫芽成品茶的含量均较高，重复性较好，且与以往文献[2，10，29]中结果相似。张宝宏[35]认为钟萝所提出的分光光度法测定茶叶中花青素总量的方法会导致结果偏高，这可能就是由于未进行样品空白的扣除所导致。

4 结论与讨论

文章就目前主要的三种测定植物性食品中花青素的方法进行了综述，这三种检测方法的优缺点如表3所示。可以看出pH示差法虽然操作简单，但是较常以矢车菊-3-葡萄糖苷对花青素进行定量，同时存在会导致测定结果偏低的情况。液相色谱法虽然操作快捷，结果精密度、准确性均较好，但是需要购置较多标准品进行定量，使检测成本增加。

分光光度法操作简便，结果重复性较好。在以往茶叶中总花青素分光光度测定方法[34]的基础上，加入扣除样品空白的步骤，消除了样品提取液本身汤色对结果的影响。根据改进的方法测定的几种常见传统茶叶与紫芽成品茶的结果也均与以往文献中的结果较为一致，具有可参考与对比性。