GC-MS和LC-MSMS法快速测定茶叶中35种农药残留

刘相真 ， 叶美君 ， 陆小磊 *

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.国家茶叶质量监督检验中心，浙江杭州 310016；3.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016）

茶叶作为一种健康饮品，深受全世界消费者的喜爱。然而，在茶叶种植和加工过程中，人们不可避免或不规范使用农药来防治茶树病虫害，由此带来的农药残留可能危害消费者健康。近年来，无论是茶叶生产者还是消费者都越来越关注茶叶质量安全[1-2]。中国拥有世界上最大的茶树种植面积，也是第一大茶叶出口国，因此，保证茶叶质量安全是中国茶产业发展的一项重要任务[3-5]。

近年来，国家卫生部门不断修订完善GB 2763《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》，截至目前，最新版的标准GB 2763—2016和GB 2763.1—2018中涉及茶叶中农药最大残留限量的已经达到50种[6-7]。然而，在标准中这50种农药残留所推荐的检测方法数目非常多，其中丁醚脲、草铵膦和氯噻啉未推荐检测方法，还有一些参照性的方法如NY/T 761并不适合于茶叶中农残检测[8]。目前已发表文献所涉及的检测方法尚未完全涵盖这50种农药。因此，为了提高检测效率，降低检测成本，保证检测结果的准确可靠，有必要建立一种快速、准确、可靠的通用型检测方法。

文章选择50种农药中检出率较高的35种（其中六六六4种构型，滴滴涕4种构型），结合分散固相萃取技术（GC-MS）和色谱-质谱法（LCMSMS），以建立一种准确、可靠的快速检测茶叶中35种农药残留的方法。

1 试验与材料

1.1 仪器与设备

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配有电喷雾电离正/负源（ESI），Xcalibur质谱工作站（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS），配有电子轰击离子源（Electron Impact Ion Source，EI），ChemStation 质谱工作站（美国Agilent公司）；分析天平（感量0.01 mg和 0.1 mg，瑞士 METTLER TOLEDO公司）；SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），最大转速5000 r/min；MTN-2800D氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂与材料

乙腈（色谱纯，TEDIA公司）；丙酮，乙酸乙酯，石油醚（分析纯，华东医药股份有限公司）；CNW 50 mL和15 mL塑料螺纹具塞离心管 （上海安谱科学仪器有限公司）；200 mL圆底烧瓶，5 mL和10 mL刻度移液管 （天津市天玻玻璃仪器有限公司）；100 μL 和 1000 μL 移液枪 （Thermo Fisher Scientific公司）；10mL容量瓶（华东医药股份有限公司）；1.5 mL 进样瓶（Agilent公司）；2 mL 一次性无菌注射器 （杭州龙德医用器械有限公司）；0.22 μm 微孔过滤膜（尼龙，天津 Agela公司）；氯化钠、硫酸镁（分析纯，华东医药股份有限公司）；N-丙基乙二胺 （PSA）、石墨化碳 （GCB）（天津Agela公司）；农药标准物质，包括丁醚脲（CAS：80060-09-9）、吡虫啉（CAS：138261-41-3）、啶虫脒 （CAS：135410-20-7）、喹 螨 醚 （CAS：120928-09-8）、 噻虫嗪 （CAS：153719-23-4）、 噻螨酮（CAS：78587-05-0）、多菌灵（CAS：10605-21-7）、杀 螟 丹 （CAS：22042-59-7）、 氯 噻 啉 （CAS：105843-36-5）、灭多威（CAS：16752-77-5）、苯醚甲 环 唑 （CAS：119446-68-3）、 除 虫 脲 （CAS：35367-38-5）、氰戊菊酯（CAS：66230-04-4）、氯氰菊酯（CAS：52315-07-8）、溴氰菊酯（CAS：52918-63-5）、氯菊酯（CAS：52645-53-1）、氟氰戊菊酯（CAS：70124-77-5）、乙酰甲胺磷 （CAS：30560-19-1）、杀螟硫磷 （CAS：122-14-5）、 联苯菊酯（CAS：82657-04-3）、 氯氟氰菊酯 （CAS：91465-08-6）、噻嗪酮（CAS：69327-76-0）、α-硫丹（CAS：959-98-8）、β-硫丹 （CAS：33213-65-9）、 哒螨灵（CAS：96489-71-3）、甲氰菊酯（CAS：39515-41-8）、 氟 氯 氰 菊 酯 （CAS：70124-77-5）、α-BHC（CAS：319-84-6）、β-BHC （CAS：319-85-7）、γ-BHC（CAS：58-89-9）、δ-BHC（CAS：319-86-8）、p，p'-DDE（CAS：3424-82-6）、p，p'-DDD（CAS：53-19-0）、o，p'-DDT （CAS：789-02-6）、p，p'-DDT（CAS：50-29-3）等 35 种农药（100 μg/mL，1.0 mL/瓶，AccuStandard公司）。

1.3 标准储备溶液和标准工作溶液

标准储备溶液的配制：用移液管准确移取500 μL 农药标准溶液（100 μg/mL）于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，置于-20℃冰箱保存待用。

混合标准工作溶液的配制：用茶叶样品空白溶液配成不同质量浓度的基质混合标准工作溶液，用于制作标准工作曲线，配制质量浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL。 基质混合标准工作溶液现用现配。

1.4 前处理

1.4.1 样品制备

取茶叶约500 g放入粉碎机中磨碎，制备供分析样品，并放置于避光阴凉干燥处保存。

1.4.2 提取

称取2 g试样（精确至0.0001 g）于50 mL具塞离心管中，准确移取10 mL乙腈至离心管中，剧烈振荡1 min，加入1 g氯化钠和4 g硫酸镁，剧烈振荡 1 min，离心 6 min。

1.4.3 净化

移取4 mL上清液至15 mL离心管中，加入200 mg PSA和100 mg石墨化碳，剧烈震荡1 min，离心3 min，用注射器移取0.5 mL上清液，过0.22 μm滤膜，供LC-MSMS检测；若需要进行GC-MS检测，则准确移取0.6 mL上清液，氮气吹干，用0.6 mL甲苯定量，过0.22 μm滤膜，待测。

1.5 仪器条件

1.5.1 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18，1.9 μm，150 mm×2.1 mm；流动相及梯度洗脱条件见表1；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；电离源模式：电喷雾离子化（ESI）；电离源极性：正模式；雾化气：氮气；鞘气压力：137.9 kPa；辅助气压力：34.5 kPa；离子喷雾电压：3500 V；雾化温度：120℃；离子传输管温度：350℃；碰撞气：氩气，0.2 Pa；扫描模式：SRM多反应监测扫描。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1。

1.5.2 气相色谱-质谱条件

色谱柱：DB-5 MS石英毛细管柱（30 m×0.25mm × 0.25 μm）；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL/min；进样口温度：290℃；进样量：1 μL，非分流进样；升温程序：40℃保持 1 min，然后以30℃/min程序升温至130℃，再以5℃/min升温至250℃，再以10℃/min升温至 300℃，保持5 min。电离方式：电子轰击电离源（EI）70 eV；接口温度：280℃；四级杆温度：150℃；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟：5 min。

表1 流动相及梯度洗脱条件Table 1 Condition of liquid chromatography flow

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

QuEChERS （Quick， Easy， Cheap， Effective，Rugged and Safe）方法是2003年由美国化学家Steven J.Lehotay和德国Michelangelo Anastassiades提出的一种快速、简单、低成本的样品处理方法[9-10]。该方法的关键是采用提取液直接加入PSA、石墨化碳等吸附剂进行净化，经离心后上清液上机检测。

2.1.1 提取溶剂的选择

在农药残留提取的过程中，根据农药的极性、性质等因素选择合适的提取溶剂。在农药残留检测过程中，常见的提取溶剂有乙腈、正己烷、丙酮、甲苯、石油醚等[11]。文章对茶叶中35项农药在不同提取溶剂下的回收率进行了比较试验，回收率试验的添加浓度水平为0.1 mg/kg，设乙腈、乙腈+100 μL乙酸、正己烷3个处理，每个处理设1个空白对照和3个重复，除了提取溶剂的不同，其余步骤均按照“1.4”和“1.5”。

乙腈可以有效提取多种农药，且对于色素和油脂的提取能力不强，因此可以有效减小色素等杂质的干扰[12-15]。从图1中可以看出，乙腈对于这35种农药都具有较好的提取效果，其回收率都在100%附近，且提取的稳定性良好，是一种良好的农药残留检测的提取溶剂。

在乙腈中加入少量的酸，主要目的是为了防止部分农药的分解以及调节pH。酸性的环境对其提取效果具有一定影响，其中9种农药的回收率有提高（图1），例如氟氯氰菊酯、灭多威、杀螟丹等。其中氟氯氰菊酯提高最多，达到6.8%。有25种农药的回收率降低，例如氰戊菊酯、氯菊酯、喹螨醚等，其中氰戊菊酯降低最多，达到51.5%。只有噻螨酮的回收率不受影响。因此，乙腈和乙腈+100 μL乙酸相比较，乙腈的提取效果更好。正己烷的提取效果并不理想，其中有7种农药的回收率为0，分别是吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、多菌灵、杀螟丹、氯噻啉、灭多威。而氯氰菊酯和杀螟硫磷由于基质效应的影响，其回收率则分别达到251.5%和165.3%。此外，提取液呈现浑浊的绿色，可见正己烷在提取农药的过程中，也会溶解更多的色素等杂质，从而导致石墨化碳吸附过饱和，影响试验结果[16]。董金斌等[17]在测定茶叶中42种农药残留时发现，茶叶样品用乙腈提取的效率与丙酮、乙酸乙酯+正己烷（1+1）、丙酮+正己烷（1+1）相近，但提取的杂质较少。

由此可见，用乙腈及乙腈+100 μL乙酸作提取溶剂，可以得到较高的回收率，并且可以有效地除去色素等杂质的干扰，相比之下，以乙腈作为提取溶剂回收率更理想。与前两者相比，正己烷虽然也具有一定的提取能力，但是其提取能力及除去色素等杂质的能力却不如前两者，基质效应导致部分农药的响应特别高，例如氯氰菊酯等。综上所述，试验最终选择乙腈作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对茶叶中35项农药回收率的影响（添加浓度0.1 mg/kg）Fig.1 Recoveries of 35 pesticides'residues in tea with different extraction solvents（spiked at 0.1 mg/kg level）

2.1.2 盐析条件的选择

文章对茶叶中35项农药在不同比例盐下的回收率进行了比较试验，回收率试验的添加浓度水平为 0.1 mg/kg，设立 1 g NaCl+4 g MgSO4（提取盐 A）、1 g NaCl+1 g MgSO4（提取盐 B）、1 g NaCl+2 g MgSO4（提取盐 C）3个处理，每个处理设1个空白对照和3个重复，其余步骤均按照“1.4”和“1.5”。

盐析处理可以使水相中的目标化合物溶于有机相中[18]，CHEN等[10]在前处理过程中往提取液中加入MgSO4发现可以得到更高的回收率。试验通过调整两种盐的比例来得到较优的提取效率。试验结果表明（图2），不同的NaCl和MgSO4配比对盐析作用具有较大的影响。分别以提取盐A、提取盐B和提取盐C作为提取盐时，其回收率分别为68.4%～114.7%、10.6%～164%和 10.5%～186.2%。其中，1 g NaCl+4 g MgSO4作为提取盐的稳定性明显高于其它2种提取盐。从回收率来看，大部分的农药以提取盐B作为提取盐时，具有更高的回收率。当以提取盐B和提取盐C分别作为提取盐时，其回收率较为接近，但两者的盐析效果都比提取盐A差。以提取盐A作为提取盐时，其回收率都在100%附近，而另外两者则波动较大，且其值偏离100%较远，丁醚脲的回收率分别为10.5%和10.6%（图2），可见在该比例下的盐，其盐析效果并不好，可能有以下原因：（1）因为盐的量不够，使得部分农药依旧溶于水相，不能充分地溶解于有机相；（2）因为盐析效果，导致一些溶于水中的杂质进入有机相中，产生基质效应，使得水相中信号峰的响应被减弱或增强，导致回收率偏差较大。综上所述，试验最终选择1 g NaCl+4 g MgSO4作为提取盐。

图2 不同比例盐对茶叶中35项农药回收率的影响（添加浓度0.1 mg/kg）Fig.2 Recoveries of 35 pesticides'residues in tea with different rates of NaCl and MgSO4（spiked at 0.1 mg/kg level）

2.1.3 净化条件的选择

PSA和石墨化碳可除去提取液中大部分的杂质[19-20]，文章对茶叶中35种农药在不同比例净化剂下的回收率进行了比较试验。回收率试验的添加浓度水平为0.1 mg/kg，设200 mg PSA+100 mg石墨化碳 （净化剂A）、100 mg PSA+100 mg石墨化碳 （净化剂 B）、200 mg PSA+50 mg石墨化碳（净化剂C）3个处理，每个处理设1个空白对照和3 个重复，其余步骤均按照“1.4”和“1.5”。

吸附剂中PSA和石墨化碳的含量不同，其吸附杂质的效果也有所不同。叶江雷等[21]和张新忠等[20]曾比较不同用量PSA和GCB对茶叶中农残回收率的影响，结果表明不同配比的PSA和GCB对回收率有显著影响。试验结果表明（图3），当分别以净化剂A、净化剂B和净化剂C作为吸附剂时，其回收率分别为 68.4%～114.7%、20.2%～118.3%和17.2%～125.2%。以净化剂A作为吸附剂的稳定性明显高于其余两种配比。从回收率来看，大部分的农药以净化剂A作为吸附剂时的回收率相对较高，这可能是因为吸附剂中石墨化碳或者PSA的量不够，导致茶叶中的一些色素、小分子等杂质不能被充分吸附，这些杂质会产生基质效应，导致回收率偏高或偏低。综上所述，试验最终选择200 mg PSA+100 mg石墨化碳作为吸附剂。

2.1.4 基质效应

按照“1.4”的前处理步骤制备基质，用基质配制质量浓度为40.0 ng/mL混合标准溶液，用乙腈和甲苯分别配制12种和23种混合标准溶液，质量浓度与基质标准溶液一致。将“基质效应＝基质加标响应峰面积/溶剂加标响应峰面积”作为评价基质效应的指数，当指数＞1.00，则表示基质效应增强，反之则为减弱。结果表明（图4），氯菊酯和联苯菊酯在GC-MS上有基质增强效应，指数分别达到1.42和1.65，溴氰菊酯基质减弱效应明显，指数为0.15，12种农药在LC-MSMS上的基质效应变化不明显，其中杀螟丹的基质效应指数最高，为1.13，丁醚脲最低，为0.88。

图3 不同比例净化剂对茶叶中35项农药回收率的影响（添加浓度0.1 mg/kg）Fig.3 Recoveries of 35 pesticides'residues in tea with different rates of sorbents（spiked at 0.1 mg/kg level）

图4 35种农药在GC-MS和LC-MSMS上的基质效应指数（浓度40.0 ng/mL）Fig.4 Matrix effect indexes of 35 pesticides determinatedwith GC-MS and LC-MSMS （40.0 ng/mL）

2.2 质谱扫描方法的选择

文章以LC-MSMS测定12种农药，以GC-MS测定23种农药。对12种农药进行LC-MSMS质谱条件优化时，11种农药在ESI+下有更好的响应，而喹螨醚在ESI-下响应较好，因此选择ESI+和ESI-快速切换测定。化合物准分子离子峰[M+H]+或[M+H]-在不同碰撞能量下裂解，分别生成若干个丰度较高的子离子，试验选择每种化合物丰度较高的2个子离子分别作为定量离子和定性离子，具体监测离子参见表2。GC-MS则采用电子轰击电离源（EI）70 eV正模式对23种农药化合物进行电离，以1个碎片离子为定量离子，2个碎片离子的相对丰度比进行定性，具体监测离子参见表3。

表2 液相色谱-串联质谱条件下12种农药离子化模式、检测离子和碰撞能量Table 2 Ion models，determination ions，and collision energy of 12 pesticides by LC-MSMS

表3 气相色谱-质谱条件下23种农药的定性定量离子和离子丰度比Table 3 SIM condition of 23 pesticides by GC-MS

2.3 标准工作曲线和定量限

对空白基质中 35种农药的 5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL质量浓度进行测定，以响应峰面积作为纵坐标，质量浓度作为横坐标绘制标准工作曲线。结果显示，35种农药化合物在5.0～500.0 ng/mL的质量浓度范围内，标准工作曲线相关系数均大于0.99，表明该方法可以在该浓度范围内对化合物进行定量。根据信噪比S/N＝10计算，计算方法定量限 （Limits of Quantitation，LOQs）（表 4 和表 5）。

表4 液相色谱-串联质谱条件下12种农药的保留时间、标准工作曲线和方法定量限Table 4 Retention times，curves，and LOQs of 12 pesticides by LC-MSMS

表5 气相色谱-质谱条件下23种农药的保留时间、标准工作曲线和方法定量限Table 5 Retention times，curves，and LOQs of 23 pesticides by GC-MS

2.4 准确度和精密度

在0.5、0.1、0.05 mg/kg质量浓度添加水平下，35种化合物的回收率 （见表6）在60%～120%之间，精密度小于10.0%，表明该检测方法适合于检测茶叶中35种农药化合物的残留量。

表6 茶叶中35种农药在3个不同添加浓度下的方法准确度和精密度Table 6 Recoveries and RSDs of determination methods for 35 pesticides’residues in tea at 3 spiked levels

3 实际样品检测

随机抽取龙井茶、黑茶散茶、红茶、铁观音、安吉白茶等5种茶样，采用上述建立的检测方法对该批样品进行检测。结果表明（表7），在5种茶样中，啶虫脒等31种农药的含量均低于方法定量限。丁醚脲仅在红茶中有检出，含量为0.010 mg/kg。吡虫啉仅在黑茶散茶中有检出，含量为0.011 mg/kg。联苯菊酯的检出率最高，在龙井茶、黑茶散茶、红茶、铁观音中均有检出，含量分别为0.021、0.060、0.11、0.21 mg/kg。在铁观音中有检出哒螨灵，含量为0.10 mg/kg。综上所述，在龙井茶、黑茶散茶、红茶、铁观音茶样中均有农药检出，但含量不高，只有安吉白茶未检出农药残留。

表7 实际样品检测结果Table 7 Testing results of tea samples

4 讨论

文章通过比较不同提取溶剂、不同比例的提取盐和不同比例的净化剂对茶叶中35种农药回收率的影响，选择用10 mL乙腈提取，1 g氯化钠和4 g硫酸镁盐析，用200 mg PSA和100 mg石墨化碳净化，最终利用超高效液相色谱-串联质谱法（LC-MSMS）和气相色谱-质谱法（GC-MS）进行测定。通过LC-MSMS、GC-MS与QuEChERS法前处理技术相结合，建立了快速测定茶叶中35种常见农药残留的新方法。该方法具有较高的准确性、精密度和灵敏度，操作简单迅速，可以满足我国、欧盟、美国、日本等国家对于茶叶中农药残留量的检测要求，在发展农药残留限量检测技术上具有一定的推动意义。