猪肉盐溶性蛋白提取工艺优化研究
2019-10-21
1.湖南中医药大学药学院食品药品工程系 湖南长沙 410208 2.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心 湖南长沙 410208 3.湖南农业大学食品科学技术学院 湖南长沙 410128
猪肉作为主要的肉制品来源材料之一，是人们从肉制品中摄入蛋白质的主要来源之一。而蛋白质又可分为水溶性蛋白质，盐溶性蛋白质。盐溶性蛋白质中的肌肉盐溶性蛋白质主要有肌球蛋白，肌动蛋白等，这些蛋白是具有形成良好热诱导凝胶的能力[1]，而热诱导凝胶能力是肉制品加工过程中重要的功能特性之一，其可以极大影响到加工过程中肉制品的工艺特性和感官品质，故而对盐溶性蛋白质的溶解性、凝胶特性的研究一直受到广泛的关注[2]。其次，不同蛋白质组分也对于热诱导凝胶形成具有较大影响[3]。
目前已有的研究表明，猪背最长肌盐溶性蛋白中的肌球蛋白是一种对盐溶性蛋白凝胶质构有着极其重要影响的功能性蛋白[4],有关鸡胸肉盐溶性蛋白凝胶特性影响的研究结论也符合猪肉盐溶性蛋白的结论[5]。同时,提取盐溶性蛋白的条件也对盐溶性蛋白凝胶的质地有着影响，如靳红果[6](2008)等研究了NaCl、MgCl2和pH值对牛背最长肌盐溶性蛋白质，凝胶保水性和凝胶强度的影响；颜伟华[7](2010)等研究了NaCl浓度、pH值、静置提取时间及加热时间对鱼肉盐溶蛋白热诱导凝胶保水性和质构特性的影响。虽然，这类研究在探究提取条件对盐溶性蛋白质凝胶特性影响时，也调整过盐溶性蛋白的提取工艺，但是相关研究大都一带而过，同时不同类型不同部位肉的盐溶性蛋白含量、结构及蛋白组分也有差异。本实验主要选择三个不同影响因素，NaCl溶液浓度、MgCl2溶液浓度和pH值，探究他们对猪里脊肉的盐溶性蛋白提取率的影响，并设计正交实验优化提取工艺。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 材料和试剂
材料:猪肉里脊肉，采购于湖南新五丰食品有限公司同一批次，同一部位的样本。
试剂：蛋白测定试剂盒(双缩脲法)，购于南京建成生物科技有限公司；其他常见试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器设备
电子天平CP413型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；
可见分光光度计721型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
可调速匀浆器FSH-2型，金坛市大地自动化仪器厂；
电子恒温水浴锅DZKW-4型，北京中兴伟业仪器有限公司；
离心机TGL16M型，湖南湘立科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 猪肉样品的制备
准确称取120g瘦肉、30g肥肉切成小块，用绞肉机搅碎成肉糜；称取4g瘦肉、1g肥肉混合均匀，制作30份留待备用。
1.2.2 猪肉盐溶性蛋白的提取与测定
准确称取5.00g肉糜(4.00g瘦肉、1.00g肥肉)样本于50mL离心管中，加入40mL(0.2mol/L)pH=6.5的磷酸盐缓冲液(0.6mol/L NaCl,0.03mol/L MgCl2)，5 000r/min匀浆1.5min,4℃静置18h,10 000r/min离心15min，取上清液，为盐溶性蛋白质溶液。用双缩脲法测定蛋白质质量浓度，按照试剂盒指导进行测定，蛋白质溶液定量后立即使用或置于-20℃备用。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 不同浓度NaCl的提取实验
在磷酸盐缓冲液pH值为7，MgCl2溶液浓度为0.03mol/L的条件下，对比不同浓度NaCl溶液(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mol/L)对于猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响。
1.2.3.2 不同浓度MgCl2的提取实验
在磷酸盐缓冲液pH值为7，NaCl溶液浓度为0.3mol/L的条件下，对比不同浓度MgCl2溶液(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)对于猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响。
1.2.3.3 不同pH值的提取实验
在NaCl溶液浓度为0.3mol/L，MgCl2溶液浓度为0.03mol/L的条件下，比较不同浓度pH值溶液(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)对于猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响。
1.2.4 正交实验设计
想要进一步优化猪肉糜盐溶性蛋白提取的较佳参数，本实验在单因素实验的基础上，采用spss25.0软件设计L9(34)正交表进行正交实验。
1.3 数据分析
所有数据用Excel2016和IBM SPASS 25.0进行整理与分析，采用LSD检验组间的差异，p<0.05作为差异显著的标志。
2 结果和讨论
2.1 不同NaCl浓度对猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响
在1.2.3.1实验中，伴随着NaCl浓度变化即浓度升高，提取所得猪肉糜盐溶性蛋白质浓度变化趋势，呈现为先升高然后下降(p<0.05)，当NaCL浓度达到0.6mol/L时，提取所得盐溶性蛋白质溶液浓度达到最大值(见图1)。
图1 不同NaCl浓度下盐溶性蛋白提取浓度Fig. 1 extraction concentration of salt-soluble protein at different NaCl concentrations
经分析，这可能是蛋白质的盐溶和盐析现象，蛋白质的提取受中性盐的影响，伴随着中性盐氯化钠溶液浓度的变化，改变了蛋白质氨基酸侧链的电子分布，蛋白质分子表面电荷随之增加，改变了蛋白质分子和水分子的相互作用力，即增强两者之间的作用，反映为蛋白质在水溶液中溶解度增加；但是这种现象不会一直持续，当中性盐溶液浓度超过一定的阈值时，就会抑制蛋白质分子溶于水；此外，Pietrasik[8](2003)等研究发现较低添加量的中性盐氯化钠可能会抑制盐溶性蛋白的萃取，降低蛋白质的水合能力。因此，根据上述实验数据选取NaCl溶液浓度为0.5、0.6、0.7mol/L的三个水平进行正交试验。
2.2 不同MgCl2浓度对猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响
在实验1.2.3.2中，伴随着MgCl2溶液浓度变化即浓度不断升高，提取所得猪肉糜盐溶性蛋白质溶液浓度也随之变化，变化趋势大致为先升高后下降(p<0.05)，当盐溶性蛋白质浓度达到最高值时，此时MgCl2溶液浓度为0.02mol/L(见图2)。
图2 不同MgCl2浓度下盐溶性蛋白提取浓度Fig. 2 concentration of salt soluble protein extraction at different concentrations of MgCl2
我们已经知道，蛋白质溶解度的大小受到中性盐添加量的影响，低浓度稀MgCl2溶液刚开始添加时，溶液中Mg2+浓度相对增加，溶液中离子强度也随之增强，离子间相互作用，致使蛋白质分子和水分子的相互作用也随之增强，反映为蛋白质溶解度增大，提取浓度升高，Chang H S.[9](2001)等对MgCl2、焦磷酸钠对鸡胸肌肌球蛋白的增溶和凝胶化作用的研究也证明了这一点；但是伴随着中性盐氯化镁溶液浓度的不断升高，溶液中的Mg2+浓度逐渐超过阈值，过高的Mg2+浓度，对蛋白质氨基酸侧链的电荷分布造成了影响，降低了蛋白质分子的水和能力，增强了蛋白质分子之间的作用，反映为蛋白质溶解度降低，提取浓度随之下降。
2.3 不同pH对猪肉糜盐溶性蛋白提取效果的影响
在实验1.2.3.3中，伴随着溶液pH值的增加，提取所得猪肉糜盐溶性蛋白质溶液浓度也随之变化，大致趋势呈现为先升高而后下降(p<0.05)，当盐溶蛋白质溶液浓度达到最大值时，此时pH值为6.5(见图3)。
图3 不同pH值下盐溶性蛋白提取浓度Figure 3 extraction concentration of salt soluble protein at different pH values
多方资料证明，pH值可以用蛋白质等电点作为一个标准点，高于或者低于蛋白质等电点都会影响到蛋白质的溶解度。改变溶液pH值，使其高于或低于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子因此得以携带净的负电荷或净的正电荷，同性相斥，蛋白质分子间相互作用能力减弱；相对的，蛋白质分子和水分子间的相互作用能力增强，反映为蛋白质溶解度升高，蛋白质提取浓度升高；与之相反的是，当溶液pH值靠近蛋白质等电点时，蛋白质分子和水分子的相互作用能力减弱，蛋白质分子相互聚集，难以分离。因此，选取pH值为6.0、6.5、7.0三个水平进行正交试验。
2.4 正交实验结果分析
基于单因素实验中，提取猪肉糜盐溶性蛋白的各组提取效果数据，得出相对较优的条件设置区间，设计L9(34)正交试验，如表1。
表1 因素水平表L9(34)
由方差分析得知，本实验范围内，NaCl、MgCl2两个因素均对猪肉糜盐溶性蛋白质提取效果有显著影响(P均小于0.05)，见表2。由极差分析得知，正交试验设置的三种因素对猪肉糜盐溶性蛋白质提取效果的影响由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，如表3。通过极差分析表可以得知对于猪肉糜盐溶性蛋白质提取条件的最优组合是：浓度为0.6mol/L的NaCl、浓度为0.03mol/L的MgCl2、pH值为6.5。
表2 正交试验方差分析结果
表3 正交试验极差分析结果
3 结论
综上，从单因素实验和正交实验的数据中分析得知，在提取猪肉盐溶性蛋白质的时候，本实验所选取的三个影响因素，NaCl、MgCl2和pH值均为影响提取率的重要因素。在用spss 25.0对正交实验的结果进行分析，从方差分析结果可知，NaCl、MgCl2两个因素均对猪肉糜盐溶性蛋白质提取效果有显著影响(P均<0.05)，对猪肉糜盐溶性蛋白质提取效果的影响由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，从极差分析结果可知，对于猪肉糜盐溶性蛋白质提取条件的最优组合是：浓度为0.6mol/L的NaCl、浓度为0.03mol/L的MgCl2、pH值为6.5。猪肉盐溶性蛋白质形成的热诱导凝胶的保水性和质构特性是评价猪肉品质的重要考察因素之一，对于提升猪肉品质有着重要的作用，因此提高盐溶性蛋白质的提取率有着重要的意义。
