百合药材的DNA条形码鉴定

姜雪萍，陈艳君，朱富成，王芳，孙传伯，赵群

（皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安 237012）

中药百合为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物卷丹（Lilium lancifolium）、百合（L.brownii）或细叶百合（L.pumilum）的干燥肉质鳞叶，为我国传统的名贵中药，具有药、食两用功能，有“蔬菜人参”的称号[1-4]。因此，以上3种植物是中药百合的基源植物。研究表明，百合中含有的多糖等成分具有保健和治疗作用[5]。多糖能够清除羟自由基，阻碍癌细胞繁殖和生长[6-8]。百合具有清心安神和养阴润肺的功能，主要用于治疗阴虚燥咳，劳嗽咳血，失眠多梦和精神恍惚等病症[9]。由于百合具有药食两用价值，仅仅靠野生资源已经难以满足日益增长的需求[10]。同时，百合在市场上价格较高[11]，一些不法商家用其他廉价的淀粉冒充百合粉。因此，有必要对百合的真伪进行有效鉴别。

目前，主要通过薄层色谱法、显微观察结构法等对百合的真伪进行鉴定[4，12-13]。然而，以上方法有的对实验室的要求较高，操作繁琐，成本高；有的需要较高的专业知识，因此不能满足百合真伪快速而有效鉴定的要求。DNA条形码作为现代分子生物学研究的一种新的分子标记技术，操作起来比较简便，材料用量少，结果可信度高，能够对物种进行快速而有效的鉴定[14-16]。该研究以ITS序列为DNA条形码，研究鉴别中药百合及其混伪品的DNA条形码鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank获取用来构建百合及其混伪品系统发育树的内群和外群的ITS序列。

以老鸦瓣（Amana edulis）的1条ITS序列为外群，百合正品基源植物和相关混伪品的ITS序列为内群。正品百合的基源植物来源于3个物种，分别为百合科植物卷丹（L.lancifolium）、百合 （L.browniivar.viridulum）和细叶百合（L.pumilum）（表 1）。

表 1 百合药材及其混伪品ITS序列及GenBank登录号

1.2 方法

1.2.1 序列分析。用软件Clustal X 1.81对从GenBank下载的百合、混伪品及外群的ITS部分DNA序列进行比对和排序，再用软件BioEdit 7.0.9.0[17]进行编辑。用MEGA 4.0软件[18]统计所有序列的变异位点并按Kimura双参数法统计所有序列的核苷酸组成，计算种内和种间的遗传距离。

1.2.2 系统发育树的构建。以正品和混伪品的ITS部分DNA序列为分子标记，分别用贝叶斯法（Bayesian inference，BI）和简约法（Maximum parsimony，MP）构建2种系统发育树。分别用MrBayes 3.1.2软件[19]和PAUP*4.0 beta 10软件[20]构建BI树和MP树。在构建BI树时，用MrModeltest 2.3软件[21]根据AIC（Akaike Information Criterion）检验标准选择最优数据模型（GTR+G）。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（MCMC）设置为每条链运转800 000次。MCMC分别运转2次以便确定其收敛。每100棵树抽取1个样本，共形成16 002棵树的样本。整个系统运行30 000代后得到的发育树趋于稳定，用剩余的15 402个样本建树并且估计其后验概率（Posterior probability，PP）值。构建MP树时，设置自举重复次数（bootstrap nreps）为1 000次，设置启发式搜索为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。

2 结果与分析

2.1 序列分析

正品和混伪品的ITS序列经Clustal X 1.81软件比对后，得到的序列长度为610 bp（包括Gaps），共有266个变异位点，其中包含110个简约性信息位点（parsimony-informative characters）。所有序列的平均G+C含量为60.1%，百合药材所有基源植物的平均G+C含量为60.5%，百合ITS序列的G+C含量和所有植物种类几乎没有差异。百合药材的3个正品基源植物百合、细叶百合和卷丹的种内平均遗传距离分别为0.014、0.106和0.000，而相应各正品基源植物与混伪品之间的平均遗传距离分别为0.077、0.115和0.057。百合药材3个正品基源植物种间平均遗传距离分别小于其与混伪品之间的遗传距离。

2.2 百合和混伪品之间的系统发育关系

由图1可知，用BI法和MP法构建的2个系统发育树主干基本一致。各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率值和MP树的自举支持度（Bootstrap，BS）。在2种系统发育树中，百合药材的3个正品基源植物所有ITS序列的单倍型分别以较高的支持度聚类为单独的谱系分支，其中百合分支的支持度为PP＝1.00 和BS＝99，细叶百合的支持度为PP＝0.99 和BS＝92，卷丹的支持度为PP＝0.99 和BS＝71。而其他混伪品都与以上3种正品百合基源植物的差异明显，各自聚类于其他的分支，并不和百合药材的正品基源植物聚类在一起。

图1 基于ITS序列单倍型贝叶斯分析法重建的百合及其混伪品之间的系统发育树

3 讨论

百合药材的3个正品基源植物百合、细叶百合和卷丹的种内平均遗传距离分别小于各自与混伪品之间的平均遗传距离。所以，DNA的ITS序列可以用作分子标记鉴定百合药材以及混伪品。由于在ITS序列中，正品百合与其混伪品之间存在特异性碱基位点，可以设计百合的特异性鉴别引物用于百合药材的快速PCR鉴定。目前，已经有部分中药材能够通过特异性PCR来进行快速鉴定[22-27]。

由于百合药材的3个正品基源植物的单倍型在系统发育树中各自聚类为单系，所以通过构建系统发育树，可以将3个正品百合的基源植物分别与混伪品区别开，从而达到鉴别正品百合的目的。在进行鉴别的时候，采用的方法是先测得待测样品的ITS序列，再将该序列同以上系统树中的所有正品与混伪品的ITS序列进行比对。检查待测样品与已知正品和混伪品之间的遗传距离并构建BI和MP 2种系统发育树。若待测样品和已知正品的遗传距离小于与混伪品的遗传距离，并且在系统发育树中以极高的支持度和正品序列聚类在一起，则可以表示待测的样品为正品，反之，即为混伪品。