一种伤口修复密封胶的研制及性能评价

于慧光 江南大学 江苏无锡 214000

1、伤口修复水凝胶的优越性

为促进开放性伤口的愈合，临床上传统采用针线缝合、密封剂密封、或者重新连接破裂组织的方式，保护和修复创面，达到伤口愈合的目的。但是这些方法存在一定的缺陷，如对伤口造成二次机械损伤，细胞排斥免疫，粘附性低以及在生物环境中性能不良等问题【3】。近年来，国内外学者致力于研究具有粘性、弹性、生物相容性、无毒等优良性状的伤口密封水凝胶。水凝胶具有原位型促进伤口愈合的优点，因而关于该领域的研究在国内外掀起了热潮。例如，以硼酸为交联剂制备Cur（姜黄素）/PVA（聚乙烯醇）水凝胶，能够大规模合成，不受尺寸限制，并且能有效杀死细菌，加速大鼠皮肤创伤愈合【4】；肽修饰壳聚糖水凝胶促进成纤维细胞增殖，迁移和分泌以及促进生长因子的生长进.促进皮肤愈合【5】；由重组蛋白或白蛋白形成的用于外科手术粘合的生物粘合剂；由藻酸盐多糖制备的伤口敷料；利用可见光固化的肝素水凝胶，不仅可以引入生长因子，而且能够减少凝胶形成时间【6】；通过光交联重组人蛋白质原弹性蛋白，形成具有可调粘附性能的生物相容性和高弹性水凝胶密封剂【7】。水凝胶具有三维高度水合的聚合物网络，当放在溶液中时，与干重相比，可以容纳多达二十至四十倍的水。由于其独特的物理性质，这些网络可以成型或铸造成各种大小和形状。胶原作为天然的高亲水性的多肽类高分子，是生物体内的一种纤维蛋白，在人体中总蛋白含量中占25%-33%，大量存在于骨，软骨和皮肤中。采用胶原作为材料具有低免疫原性，胶原虽然是大分子物质,但结构重复性大，与其他具有免疫性的蛋白质相比,胶原的免疫原性非常低；胶原材料另一优势在于它与宿主细胞及组织之间良好的相互作用即生物相容性，其可与周围细胞表现出很好的相互作用，并成细胞的一部分，还可促进细胞的生长；胶原发达的四级结构使其具有一定的凝血作用，可促进血小板凝集和血浆结块；另外胶原还具备能被蛋白酶降解的特性 ,即可生物降解性【8】。聚乙二醇（PEG）具有水溶性，并可溶于绝大多数的有机溶剂，且具有生物相容性好、无毒、免疫原性低等特点，并且在生物体内可被较快代谢，通过肾排出体外，在体内不会有积累。PEG可将其许多优异性能赋予被修饰的物质，作为表面修饰材料，PEG还可有效延长水凝胶在体内的半衰期【9】。在本实验中，采用PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）与巯基化胶原为基本材料，进行自发交联，形成具有一定生物粘性的水凝胶。对PEG两端羟基进行双键修饰，得到PEGDA，其双键可与巯基化胶原的巯基发生键合，从而发生交联，得到具有一定粘附性和一定机械强度的水凝胶。采用该方法所制备的水凝胶具有良好的生物相容性，无毒，并且无需引发剂可自发交联等显著优点。

2、实验方法

2.1 COL-SH 的制备【10】

将胶原（1g,0.0125mmol）溶于去离子水(150ml)中，然后用NaOH调节溶液PH=10。在4℃的条件下将琥珀酸酐（15g,0.15mol）溶于丙酮中，然后将该混合溶液滴加到胶原溶液之中。将反应混合物的pH保持在pH9.0，并在4℃下搅拌混合物4小时。然后将该反应溶液在去离子水中透析(MWCO=14000KDa)24h，并通过冷冻干燥收集Col-COOH产物.通过TNBSA测定测定的COL-COOH中剩余胺基的量为零，表明COL-COOH中羧基的DS（取代度）接近100%。将EDC(0.5g，2.6mmol)、NHS(0.3g，2.6mmol)和 MEA(0.2g，1.76mmol)的水溶液依次加入到溶在去离子水（50ml）中的Col-COOH(0.5 g,0.00625 mmol)，将反应混合物的PH用HCL(1.0M)调节至5.5，并在室温下搅拌混合物24h，然后用NaOH（4.0M）将溶液PH调节至8.5并用DTT（二硫苏糖醇）（1.5g，9.7mmol）处理24h。将反应混合物用盐水透析24h，去离子水透析5h。冻干后，得到白色固体Col-SH。

2.2 COL-SH与PEGDA交联成凝胶

按COL-SH:PEGDA质量比分别为1：50、1:100、1:200进行混合，发生自身交联，得到半透明凝胶，将凝胶冻干后备用。

2.3 COL-SH与PEGDA交联成凝胶

按COL-SH:PEGDA质量比分别为1：50、1:100、1:200进行混合，发生自身交联，得到半透明凝胶，将凝胶冻干后备用。

2.4 溶胀实验（质量分析法）【11】

将干凝胶W0浸泡于20mL PBS中（PH7.4，25℃），分别在 1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h称量凝胶的质量Wt，多余的水分用滤纸吸去，计算吸水率。

2.5 . 降解实验【11】

将100mg的干凝胶浸泡于含胶原蛋白酶（5U/ml）的PBS溶液中，在37℃、100rmp/min下震荡, 4h,8h,24h在各时间点离心除去含有胶原蛋白酶的溶液，用PBS溶液洗涤两次，再离心，随后冷冻干燥。降解率根据以下公式结算计算：W0为初始干重，W1为酶解后干重。

2.6 水凝胶的微观形态分析

使用扫描电子显微镜（日本日立公司 SU1510）观察水凝胶（COL-SH:PEGDA=1：100）的的内部结构。先将水凝胶样品冷冻干燥。然后将其切开以观察其内部结构。

3、实验结论

实验制备了COL（胶原）与PEGDA质量比为1:50、1:100、1:200的水凝胶，通过水凝胶形貌、溶胀性能、水溶解性能和酶溶解性能测试证实了COL与PEGDA质量比为1:200的水凝胶的性能整体较好。在SEM电镜图中，可明显看出水凝胶具有不规则的较密的膜状三维网络结构，此结构不仅能够提高水凝胶的力学强度，而且可以很好的解释水凝胶能够溶胀拉伸等行为的现象。在溶胀实验中，1:200水凝胶的溶胀比较小且变化平稳，其交联程度最好。因为水凝胶的形成是由于PEGDA之间形成了凝聚缠结结构，该缠结结构是由PEGDA链间羟侧基间形成的氢键缔合结构而引起的，其作用类似于交联网络结构中的交联点。当PEGDA浓度增加时，单位体积内PEGDA分子数增加，形成链间氢键凝聚缠结点数目增加，亦即交联度增加，故溶胀比减小。通过水溶解实验，发现COL与PEGDA的质量比对水凝胶的水溶解性有显著影响，随着PEGDA的增加可以促使水凝胶的溶解。PEGDA比例较大的水凝胶更易于与伤口融合，能更好的在体内降解，促进伤口的愈合。在水凝胶的酶降解曲线中，1:200水凝胶的酶降解速率最快，可见此比例的水凝胶在生物体内能够更好的降解，更有利于伤口的愈合与生长。通过上述系列实验，可以认为COL与PEGDA质量比为1:200的水凝胶更利于促进伤口的愈合与生长，缩短伤口愈合的时间，更适合作为伤口敷料。