通窍化栓颗粒对脑缺血细胞损伤的抗凋亡作用研究

丁永芳,钱海兵,朱广旗,袁青青,李 梦

(1.贵州中医药大学 研究生院,贵州 贵阳550025；2.贵州中医药大学 基础医学院,贵州 贵阳550025；3.贵州中医药大学第一附属医院,贵州 贵阳550025)

脑缺血是一种在临床上具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点,严重威胁人类健康的一类疾病。近年来,对脑缺血的研究取得了很大进展,一般认为脑缺血或缺血性脑中风是由于脑内血液供应障碍导致大脑某区域缺血、缺氧,从而引起包括氨基酸兴奋毒性,细胞内钙离子超载、氧化、氮化应激形成,炎症损伤、血脑屏障损伤、线粒体能量障碍以及细胞凋亡等一系列病理生理学过程[1]。近年来,对于脑缺血损伤机制研究已经达到分子和基因水平,治疗靶点主要集中在兴奋毒性、氧化应激、免疫炎症、凋亡等导致神经元损伤的环节,但是目前仍然缺乏安全有效的脑缺血治疗药物[2]。通窍化栓颗粒是以通窍化栓汤为基础研制的治疗脑卒中的现代苗药制剂,通窍化栓汤源于贵州省苗族民间经验方,主要由大血藤、飞龙掌血、土三七、金毛狗脊等苗药组成,具有活血化瘀、舒筋活络之效。临床应用表明,通窍化栓汤对治疗缺血性脑血管病有较好的疗效[3],在中风病的治疗中显示出明显优势。笔者根据其功效,采用H2O2损伤的PC12细胞模型及局灶性脑缺血大鼠模型观察通窍化栓颗粒对脑缺血损伤细胞凋亡的影响,探讨苗药制剂通窍化栓颗粒对脑缺血的保护作用及其机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

通窍化栓颗粒,由贵阳中医学院第一附属医院提供(批号：20150401)；血塞通片(云南维和药业股份有限公司,产品批号：140642)；胎牛血清,由杭州四季青生物材料研究所提供；MTT(噻唑兰,Sigma)；双抗,青霉素、链霉素(Sigma,双蒸水溶解,过滤除菌,根据需要控制药物剂量)；0.125%胰酶溶液；75%乙醇。

1.2 实验动物

SD大鼠60只,SPF级,雌雄兼有,体重180～220 g,由中国人民解放军第三军医大学医学实验动物中心提供,许可证号：SCXK(军)2012-0011。

SD大鼠20只,雌雄各半,体重280～320g,由贵阳医学院实验动物中心提供,合格证号(SCXK黔2002-0001)。

实验过程中对动物的处置：符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见。

1.3 实验仪器

栓线,北京西浓科技有限公司；台式离心机(TDL-40B),Anke；电子分析天平(FA1004A),上海精密科学仪器有限公司；酶标仪(Infinite M200),北京新风机电技术公司；二氧化碳培养箱,本三洋机电有限公司；光学显微镜(Leica),国Leica Micosystems Ltd；滤器、滤膜(孔径0.22μm),华美生物工程；6孔、24孔、96孔板,北京COSTAR公司；超净工作台(TDGC2J-0.5),苏州安泰空气技术有限公司；紫外可见分光光度计(TU180),北京普析仪器有限责任公司；三用紫外分析仪,上海华康生化仪器制造厂；2135型石蜡切片机,德国Leica公司；H-600IV型透射电镜,日本日立公司；BX46型Olympus照相显微镜,日本奥林巴斯公司。

1.4 实验细胞株

PC12细胞株,购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2 实验方法

2.1 对H2O2致PC12细胞损伤的影响

2.1.1 通窍化栓颗粒含药血清的制备 将SD大鼠12只随机分为3组：正常动物组、通窍化栓给药组、阳性药组,雌雄各半,正常组灌胃蒸馏水,通窍化栓组和阳性对照组按照人临床用药量的40倍灌服通窍化栓颗粒和阳性药悬浮液,连续5 d,末次给药后1 h,清醒状态下进行股动脉采血,血清在室温下放置30 min,3 000 r/min离心10 min,分离血清,合并同组动物血清,56℃水浴30 min,灭活补体,－20℃保存备用。

2.1.2 通窍化栓颗粒剂量的选择 取对数生长期的PC12细胞按常规培养,待细胞完全贴壁后,加入100μL不同浓度含药血清(通窍化栓颗粒、阳性药物)的培养基,浓度分别为50%、25%、12.5%、6.25%,共设5个浓度组。继续培养48 h后用MTT法检测细胞活力。

计算含药血清各个浓度下的细胞抑制率,以细胞抑制率＜10%时的含药血清浓度为最大无毒剂量。

2.1.3 H2O2致细胞损伤浓度的确定 取对数生长期的PC12细胞按常规培养,待细胞完全贴壁后,加入100μL含不同浓度H2O2的培养基,浓度分别为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L,设6个平行复孔,继续培养2h后置显微镜下观察药物的作用效果,浓度阶梯称取102mg 30%H2O2(H2O2分子量为34,密度为1.11g/cm3),加入1mL无血清培养基,得到0.9mol/L的H2O2溶液,一共设置12个浓度；用MTT法检测细胞活力。

计算含药血清各个浓度下的细胞抑制率,以细胞抑制率＜10%时的含药血清浓度为最大无毒剂量。

2.1.4 通窍化栓颗粒含药血清对PC12细胞凋亡的保护作用 取对数生长期的PC12细胞按常规培养,待细胞完全贴壁后,将其分为6组：①通窍化栓颗粒高剂量组(30%含药血清＋H2O2)；②通窍化栓颗粒中剂量组(20%含药血清＋H2O2)；③通窍化栓颗粒低剂量组(10%含药血清＋H2O2)；④阳性对照组(20%阳性血清＋H2O2)；⑤模型对照组(20%空白血清＋H2O2)；⑥空白对照组(20%空白血清200μL)。每一浓度设5个平行复孔,放在37℃、5%CO2的孵箱中继续孵育48 h；用MTT法检测计算通窍化栓颗粒对H2O2致PC12细胞损伤的保护作用。

2.2 对线栓致局灶性脑缺血大鼠模型的影响

2.2.1 动物分组及模型建立 取健康大鼠60只,雌雄各半,随机分为假手术组,模型组,通窍化栓颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性对照组6组,每组10只,参照文献方法[4]制备大鼠局灶性脑缺血模型。

2.2.2 给药 术后第2天,按照通窍化栓混悬液高、中、低剂量组大鼠以1 mL/100 g灌胃给药(分别为7、3.5、1.75 g/kg),阳性对照组灌胃血塞通片(给药剂量为50 mg/kg),模型对照组及假手术组灌胃等体积的生理盐水。每天给药1次,连续给药7 d。

2.2.3 对脑缺血水肿的影响 脑含水量检测：末次给药后,动物禁食(不禁水)12 h,用4%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉,立即于冰台上快速断头处死,取出全脑,称脑湿重,然后在80℃烤箱中烘干至恒温,称脑干重,计算水肿指数,计算公式：水肿指数＝(湿重－干重)/湿重×100%。

2.2.4 对脑组织病理改变的影响 末次给药后,动物禁食(不禁水)12 h,用4%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉,立即于冰台上快速断头处死,取出全脑,将大鼠脑组织浸泡于10%福尔马林中固定,常规HE染色,观察大脑组织。按病变占组织块的30%以下1分,占%30～50%2分,占50%以上3分,将所有评分累加即得神经系统损伤评分。

2.2.5 对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 将组织制作成4μm厚度切片,分别进行BAX(Santa公司)和BCL-2(Santa公司)标记,二抗和显色系统(基因公司),设立已知BAX和BCL-2阳性的大脑星型细胞瘤组织为阳性对照,用PBS替代一抗为阴性对照。BAX和BCL-2阳性出现棕黄色颗粒,主要阳性定位在细胞胞质中。随机选取5个,置400倍显微镜下观察大脑中细胞,计数其中500个细胞,其中阳性细胞除以5即为该例的平均阳性细胞数。

3 统计学处理

采用SPSS21.0统计学软件进行数据处理,实验数据用均数±标准差(±s)表示,采用t检验。多组间比较采用ANOVA分析,再用LSD进行两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 通窍化栓颗粒对H2O2致PC12细胞损伤的影响

4.1.1 通窍化栓颗粒含药血清最大无毒剂量的测定结果 结果表明,含药血清最大无毒剂量以30%为宜,空白血清、阳性药物血清以20%为宜。见表4。

图4 各浓度H2O2下PC12细胞生长抑制率

表4 各含药血清浓度下PC12细胞生长抑制率 (%)

4.1.2 H2O2浓度的筛选结果 采用MTT法检测不同浓度H2O2对PC12细胞生长抑制情况的影响。H2O2对PC12细胞的影响抑制率从90%到3%,H2O2浓度越高,PC12细胞存活率逐渐下降。选用中位数以0.2 mmol/L浓度50%抑制率作为本研究中H2O2的干预浓度。见图4。

4.1.3 通窍化栓颗粒含药血清对PC12细胞的保护作用 与对照组相比,模型组细胞存活率显著降低；与模型组相比,不同浓度(30%,20%,10%含药血清)的通窍化栓颗粒组细胞存活率明显增高。研究表明,含药血清对H2O2诱导PC12细胞损伤具有保护作用。见图5。

图5 含药血清细胞MTT吸光度

4.2 通窍化栓颗粒对脑缺血水肿的影响

研究结果表明,通窍化栓颗粒可减轻局灶性脑缺血大鼠的脑水肿状况,与模型组比较,通窍化栓颗粒高、中、低剂量组的水肿指数显著改善(P＜0.05)。说明通窍化栓颗粒可以减轻脑缺血导致的脑水肿。见表1。

表1 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织水肿的影响 (±s)

表1 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织水肿的影响 (±s)

注：与假手术组比较,∗P＜0.05；与模型组比,＃P＜0.05。

组别 动物数(n)剂量(g/kg) 水肿指数(/10g)假手术组 10 - 7.86±0.20模型组 10 - 8.17±0.19∗阳性组 10 0.05 7.91±0.11＃高剂量组 10 7.00 7.99±0.11＃中剂量组 10 3.50 8.01±0.07＃低剂量组 10 1.75 8.09±0.16＃

4.3 HE观察

除假手术组外,其余各组脑灶性区域细胞结构均有损伤,光镜下均可见脑灶性区域间质水肿、血管充血、胶质细胞增生,与假手术组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比,通窍化栓颗粒各给药组及阳性对照组脑灶性区域HE组织切片上,均可观察到神经细胞结构病理损伤减轻(P＜0.05)。见表2和图1。

表2 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织病理损伤的影响 (±s)

表2 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织病理损伤的影响 (±s)

注：与假手术组比较,∗P＜0.05；与模型组比,＃P＜0.05。

组别 评分假手术组(n＝6) 1.00±1.10模型组(n＝6) 10.50±0.55∗阳性对照组(n＝6) 5.33±0.52∗＃低剂量组(n＝6) 9.17±1.17∗＃中剂量组(n＝6) 8.83±0.98∗＃高剂量组(n＝6) 5.17±0.75∗＃

4.4 通窍化栓颗粒对脑组织BAX、BCL-2阳性表达的影响

BAX免疫组织化学标记显示,各组均有胶质细胞阳性表达。模型组脑组织Bax阳性细胞密度显著增多,与假手术组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。通窍化栓颗粒各剂量组及阳性对照组Bax阳性细胞密度显著减少,与模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3和图2。BCL-2免疫组织化学标记显示,各组均有小胶质细胞阳性表达,模型组脑组织Bcl-2阳性的细胞密度均显著减少,与假手术组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。通窍化栓颗粒各剂量组及阳性对照组脑组织Bcl-2阳性的细胞密度均显著增多,与模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3和图3。

图1 HE观察(×100)

图3 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织BCL-2阳性表达的影响(×100)

表3 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织BAX、BCL-2阳性表达的影响 (±s)

表3 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织BAX、BCL-2阳性表达的影响 (±s)

注：与假手术组相比,∗P＜0.05；与模型组相比,＃P＜0.05。

组别 Bax BCL-2假手术组(n＝6) 7.03±2.56 15.66±1.41模型组(n＝6) 60.03±10.73∗ 9.06±0.63∗阳性对照组(n＝6) 33.26±2.02∗＃ 58.87±0.73∗＃低剂量组(n＝6) 46.93±5.88∗＃ 50.53±1.28∗＃中剂量组(n＝6) 47.07±5.90∗＃ 50.57±1.32∗＃高剂量组(n＝6) 33.93±1.13∗＃ 59.27±1.81∗＃

图2 通窍化栓颗粒对局灶性脑缺血模型大鼠脑组织BAX阳性表达的影响(×100)

5 讨论

脑血管疾病是指由多种原因导致脑血管病变,从而引起脑部疾病,其中最常见的为脑缺血,占脑血管病变的70%以上[5-8]。流行病学研究显示[9],国内每年有超过150万的急性脑卒中死亡病例,急性脑卒中的致死、致残率高达80%[10]。脑缺血是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应,当发生脑缺血后,由于脑组织缺氧,能量供给不足,导致谷氨酰胺等兴奋性氨基递质生物功能增强,引起线粒体功能异常；同时脑缺血促炎症因子的释放,激活免疫炎症反应等多种损伤机制最终共同启动细胞程序性死亡,导致脑组织细胞凋亡、损伤[2],出现脑水肿,直接影响患者的昏迷程度及病情转归[11]。现代研究表明,脑缺血损伤过程是由许多大分子物质参与的一系列复杂的级联反应,其中Bcl-2蛋白家族(包括促凋亡蛋白Bax,Bcl-XS,Bak,Bid和Bad和抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL系列)是脑缺血后神经元细胞凋亡的重要调节器,参与脑缺血后细胞凋亡的调节,其主要是通过Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族直接参与释放CytC线粒体膜通透性转换孔的调节[1],在此过程中,Bcl-2间接抑制促凋亡调控蛋白Caspase-3激活[12]、抑制Bax的细胞毒性,从而表现出对细胞凋亡的抑制作用[13]；Bax能够破坏线粒体渗透性而导致细胞色素C释放增加,激活Caspase-9,表现出对细胞凋亡的促进作用；此外,Bax表达可抑制Bcl-2的作用而促使细胞凋亡[14-18],因此脑缺血后神经元细胞凋亡的调节主要是通过Bax和bcl-2两者的拮抗作用实现的。

本实验研究结果显示,通窍化栓颗粒能增加H2O2诱导的PC12损伤模型细胞活力,抑制损伤模型细胞的调亡,并能显著降低局灶性脑缺血模型大鼠脑缺血组织含水量,改善大鼠神经细胞结构病理损伤状况,提示通窍化栓颗粒对脑缺血后水肿症状有改善效果(呈浓度依赖性),能减轻脑缺血损伤,对缺血脑组织具有保护作用。研究还发现,在脑缺血发生过程中,Bcl-2/Bax显著降低,通窍化栓颗粒能升高Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达,因此通窍化栓颗粒可能通过上调Bcl-2/Bax值,促进组织神经细胞存活,从而发挥对脑缺血损伤细胞的抗凋亡作用。