藏药康珠甘露口服固体前体脂质体的制备工艺优化研究

孟 达,毛 羽,林灵敏,卓小月,蒋孝龙

(西南民族大学 药学院,四川 成都610041)

藏药降糖复方(康珠甘露)是本课题组在传统民族药方剂基础上化裁而来,用于二型糖尿病治疗及心脑血管保护,康珠甘露总黄酮提取物(ZYZH)为其主要有效成分,ZYH为其中一种主要黄酮苷成分,为康珠甘露的评价指标和主要有效成分,其作用机制为对胰岛β细胞的保护作用[1-3],增加胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗及相关代谢紊乱[4,5]。

本实验以ZYZH为原料开展深度研究,针对ZYZH溶解度低,首过效应明显,口服生物利用度差的特点,将其制备成一种新型的前体脂质体制剂,使其不但具备脂质体的优点,并能克服传统脂质体剂型贮存稳定性差的缺点[6-8],一方面可以提高药物的溶出；另一方面最终增加ZYZH总黄酮在胃肠道的跨膜吸收和口服生物利用度。

本实验在文献和前期实验研究基础上,分别采用载体沉积法[9]和冷冻干燥法[10]制备藏药康珠甘露总黄酮口服固体前体脂质体,以包封率为评价指标,采用单因素考察和正交试验法,优化ZYZH前体脂质体制备工艺,并对两种制备方法进行对比研究,为藏药康珠甘露的后期制剂研究开发提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

AL104电子分析天平,英国malvern公司；JSM-7500F扫描电镜,日本电子株式会社；MS-2000激光粒度分析仪,英国malvern公司；SENCO-R系列旋转蒸发仪,上海申申科技有限公司；Waters2695高效液相色谱仪,美国Waters；FD-1冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司；KQ250B超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司。

1.2 药品及试剂

ZYZH原料药(由西南民族大学少数民族药物研究所提供,含量≥60%)；ZYH对照品(由西南民族大学少数民族药物研究所提供,批号20150508,经核磁和质谱鉴定,采用HPLC法测定,经面积归一化法计算纯度大于98%)；山梨醇、氯化钠、乳糖、乙醇、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、海藻糖、蔗糖、胆固醇、氯仿、大豆卵磷脂、维生素E、磷酸氢二钾、SephadexG-50、磷酸二氢钾、三氯甲烷,以上试剂均为分析纯,甲醇(色谱纯),均由成都市科龙化工试剂厂提供。

2 方法与结果

2.1 载体沉积法制备ZYZH前体脂质体

取处方量载体粉末置于1 000 mL茄形瓶中,于旋转蒸发仪上以80～90 rpm转速、水浴恒温40℃的条件,减压预热30 min。取处方量ZYZH原料药、大豆卵磷脂、胆固醇适当超声和温热使溶于适量有机溶剂(氯仿∶甲醇)中,以1.0 mL/min加入上述有机混合液,真空旋转蒸发。有机混合液全部加入后,继续旋转蒸发30～40 min,将粉末置于真空干燥器中12h后过筛(40目),即得ZYZH前体脂质体。

2.2 冷冻干燥法制备ZYZH前体脂质体

称取处方量大豆卵磷脂、胆固醇、ZYZH原料药置于1 000 mL茄形瓶中,加入适量有机溶剂(氯仿∶甲醇),超声使其充分溶解。于40℃水浴减压蒸馏除去有机溶剂,形成均匀透明的薄膜,加入10 mL(PBS)作为水合介质进行洗脱,于40℃恒温水浴水化2 h,水浴超声30 min,得到乳状半透明ZYZH脂质体悬浮液,密封置于4℃下冷藏保存。

采用冷冻干燥法制备前体脂质体。以甘露醇为冻干保护剂,利用制备得到ZYZH脂质体悬浮液,加入冻干保护剂浓溶液,使得混合后冻干剂质量分数为10%(由加入保护剂的质量除以混合液的体积计算得来),将其冷冻干燥即得ZYZH前体脂质体。得到的冻干样品密封、避光,常温保存于干燥器中。

2.3 ZYZH前体脂质体包封率的测定方法

按照本实验前期所建立的SephadexG-50柱分离法,测定方法简述如下：称取一定量的Sap HadexG-50(100～200μm),用缓冲溶液室温浸泡24 h后装柱,精密吸取一定量脂质体样品上样,控制流速在0.8～1mL/min,用PBS洗脱,收集前10mL含脂质体的初洗脱液(a),另取与上样量同体积的脂质体混悬液,用10 mL PBS稀释,得未分离溶液(b)。分别取a、b溶液用无水乙醇稀释至澄明,超声破膜,进样,测定其峰面积,根据标准曲线计算浓度和含药量。a溶液测得的药物浓度记作C包裹,b溶液测得的药物浓度记作C总。

2.4 影响前体脂质体制备的因素考察

2.4.1 不同载体对载体沉积法制备ZYZH前体脂质体包封率的影响 固定其他因素不变,分别选用氯化钠、山梨醇、乳糖为载体,制备前体脂质体,用PBS水合后测定其粒径分布、Zeta电位及包封率。结果包封率分别为60.3%、62.1%、59.3%。表明载体为山梨醇时,制备的脂质体包封率最高。

2.4.2 进样速度对载体沉积法制备ZYZH前体脂质体包封率的影响 固定其他因素不变,载体为山梨醇时：考察进样速度分别为0.6 mL/min、1.0 mL/min、1.4 mL/min,制备ZYZH前体脂质体,用PBS水合后测定粒径分布、Zeta电位及包封率。结果包封率分别为60.3%、62.1%、59.3%。结果表明,进样速度为1.0 mL/min时,制备的脂质体包封率最高。

2.4.3 冷冻干燥法制备ZYZH前体脂质体时冻干保护剂的选择 本实验以冻干后外观形状、水合难易程度及包封率为指标对不同冻干保护剂,如山梨醇、乳糖、蔗糖及海藻糖制备的ZYZH前体脂质体进行了考察。结果以海藻糖、乳糖作为冻干保护剂制备的前体脂质体水合效果最优。

2.4.4 冷冻干燥法制备ZYZH前体脂质体时冻干保护剂量的考察 本实验以冻干后外观形状、水合难易程度及包封率为指标考察了磷脂与冻干保护剂(w/w)不同比例制备的前体脂质体,比例分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。结果表明,当卵磷脂与海藻糖的比例(w/w)为1∶4时所制得的前体脂质体包封率最高。

2.5 正交试验优化

以包封率作为主要指标,结合单因素试验结果,对水浴温度(A),载脂比(w/w)(B),胆固醇与卵磷脂比例(w/w)(C),药物与卵磷脂比例(w/w)(D),4个因素进行4因素3水平实验,选用L9(34)正交表安排实验,制备ZYZH前体脂质体,测定包封率。结果见表1。

表1 载体沉积法正交试验结果

续表1 载体沉积法正交试验结果

从表中可按极差R值大小排序,D＞B＞A＞C,即药物与卵磷脂的质量比是影响包封率照A2B1C3D2组合制备的ZYZH前体脂质体,复水后的包封率为67.7%,优于其他组合的包封率。因此水浴温度为40℃,进样速度为1.0 mL/min、卵磷脂与载体的质量比为1∶4,卵磷脂与胆固醇的比例为5∶1,药物与卵磷脂质量比为1∶10为最优处方。

以包封率作为主要指标,结合单因素试验结果,对干燥工艺中冻干保护剂的用量(A)、预冻时间(B)及预冻温度(C),3个因素进行3因素3水平实验,制备ZYZH前体脂质体,并测定包封率。正交试验结果如表2。

表2 冷冻干燥法正交试验结果

从表中可知按极差R值大小排序,C＞B＞A,即预冻温度是影响包封率的主要因素。且按照A1B3C2组合制备的ZYZH前体脂质体,复水后的包封率为62.1%,包封率优于其他组合。因此,卵磷脂与冻干保护剂的比例为1∶3,预冻时间为20 h,预冻温度为－50℃,此为最优条件。

由表1、表2可以看出,采用山梨醇载体沉积法制备的ZYZH包封率大于冷冻干燥法制备前体脂质体的包封率。

2.5 验证试验

综合对比工艺优化结果,山梨醇载体沉积法制备ZYZH前体脂质体优于冷冻干燥法。最终按山梨醇载体沉积法最优处方及工艺制备3批ZYZH前体脂质体,产品为浅黄色具一定流动性的粉末。测定其包封率分别为67.1%、67.5%、67.2%。由测定结果可知此处方和制备条件稳定可行。

2.6 ZYZH前体脂质体的质量评价

2.6.1 形态和粒径 两种方法所制备的ZYZH前体脂质体形态和粒径,如表3所示。

表3 梨醇载体沉积法和冷冻干燥法制备的ZYZH前体脂质体形态和粒径

综上所述,实验结果表明,载体沉积法在包封率、前体脂质体固体形态及水化后脂质体粒径多方面指标均优于冷冻干燥法。

图1 载体沉积法脂质体扫描电镜

图2 冷冻干燥法脂质体扫描电镜

2.6.4 ZYZH前体脂质体初步稳定性考察 在ZYZH前体脂质体初步稳定性考察中,以外观色泽、水合难易程度及水合后粒径、pH值、包封率等为指标,考察了ZYZH前体脂质体在影响因素实验、留样实验中的稳定性,通过60℃高温试验、4 000 LX强光照射试验、4℃留样考察以及25℃室温留样考察来研究ZYZH前体脂质体对温度和光照强度的敏感性,以确保ZYZH前体脂质体的稳定性和用药安全性、有效性。

按照最佳工艺制得的ZYZH前体脂质体为浅黄色、流动性良好的干燥颗粒,水合后成浅黄色脂质体混悬液。将此混悬液密闭冰箱4℃条件放置1、2、4、6个月后仍未见分层现象。同时将ZYZH前体脂质体在室温密闭条件下放置1、2、4、6个月后,通过水合成混悬液并经透射电镜和粒度分析仪检测,结果具有良好的囊泡结果且粒径分布均匀。此结果显示冷藏环境下的ZYZH脂质体混悬液和室温下的前体脂质体在放置6个月后,各参数值无明显变化,说明所研制的ZYZH前体脂质体水合形成脂质体混悬液具有较好的稳定性。在60℃高温条件及强光照射下,会使脂质体少许结块,水合难度相应增加。建议将ZYZH前体脂质体置于室温(25℃)或低温、避光保存。

3 讨论

降糖藏药康珠甘露总黄酮水溶性差,口服具有首过效应,如何提高黄酮苷类天然药物的生物利用度,一直是药剂学领域的一个难题,为了提高其口服生物利用度,本实验采用前体脂质体技术制备了一种新型的口服ZYZH固体前体脂质体给药系统,以提高ZYZH的生物利用度。前体脂质体在运输、储存的过程中比起普通脂质体有更好的稳定性,可减少聚集、融合及药物渗漏,但不同制备方法制备的脂质体质量不同,本实验采用载体沉积法和冷冻干燥法制备ZYZH前体脂质体,以外观、水合难易及包封率为指标对两种制备方法进行了综合比较分析,结果显示载体沉积法制备的前体脂质体总体结果较好。最终选用载体沉积法制备ZYZH前体脂质体。通过单因素筛选及正交试验确立了载体沉积法的最佳处方为卵磷脂与载体的质量比(w/w)为1∶4,卵磷脂与胆固醇的质量比(w/w)为5∶1,药物与卵磷脂质量比(w/w)为1∶10,PBS的pH值为7.0。并确定了相应最佳制备工艺,本课题首次采用藏药降糖复方(康珠甘露)有效部位提取物(总黄酮,ZYZH)进行了治疗糖尿病的前体脂质体制剂的研究,成功制得了工艺合理可行、质量稳定可控的ZYZH前体脂质体。

在体外分析方法的建立过程中,本研究选用其中一种主要药效成分ZYH为指标并对其建立了有效、可行的含量测定方法。但中药复方的药效作用是由多种有效成分相互影响而发挥的,选用一种指标成分进行测定并不能全面反映所制备的制剂质量可控性。后续工作应对处方中其他有效成分进行系统分析,建立多指标成分的体外分析方法。

在制备工艺方法筛选过程当中,虽然本实验综合对比结果表明载体沉积法优于冷冻干燥法,但载体沉积法在工业化生产中有一定难度,且复水程度较冷冻干燥法差,两种方法各有其优缺点。本实验的目的在于通过载体沉积法制备工艺的优化进而为以后的中试及工业生产提供理论指导。

由于时间关系,后续将进一步完善其药动学研究,并考察其在体内外的释放、吸收及分布规律,目前本课题组正在开展生物等效性研究和长期影响因素试验。