新型免疫检查点HHLA2在人肺腺癌中的表达及其临床意义

南方圆 陈梦茜 陈洪雷

(1.武汉大学基础医学院病理学教研室 武汉 430000；2.武汉市江夏区人民医院胸外科 武汉 430000)

肺癌是世界上最普遍、最致命的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)被确认为肺癌的主要类型，约占肺癌的85%，肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是NSCLC最常见的亚型。尽管包括辅助化疗和靶向治疗在内的多种方法都在加速改进，但LUAD (15%)的5年相对生存率仍然很低[2]。因此，寻求新的治疗策略对改善LUAD患者的预后至关重要。

免疫治疗是一种刺激免疫系统对癌细胞反应的治疗方法，已成为传统外科手术、放化疗和分子靶向治疗的重要手段之一。免疫检查点疗法是一种以调控通路为靶点，有效增强抗肿瘤免疫应答的新策略[3]。CD28家族受体与B7家族配体的相互作用在免疫调控和癌症发病机制中发挥着重要作用。B7家族检查点目前由10多个成员组成其中包括B7-H7/Human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2(HHLA2)[4]，与其他B7家族检查点不同的是，HHLA2只在人类中被检测到，而在小鼠中没有被发现[5]，HHLA2在正常组织中表达较少，而在各种人类恶性肿瘤中广泛表达[6]。目前， HHLA2的生物学影响和临床价值尚未完全探讨，因此，本研究采用了免疫组化(immunohistochemistry, IHC)方法检测HHLA2在LUAD及相应的癌旁组织中的表达情况，评价其临床病理特征的相关性，为免疫检查点联合治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病人资料

本次研究共涉及肺腺癌组织74例。这些标本来源于武汉大学中南医院病理科档案室，从2005年7月至2013年7月被诊断的肺癌患者标本中取得，并有详细的临床资料，肿瘤按国际抗癌联盟(UICC 2010)第7版TNM分级进行细分，临床病理特征如性别、年龄、吸烟史、生存状态、肿瘤浸润深度(T)、淋巴结转移(N)、远处转移(M)，见表1。本实验符合武汉大学医学院医学伦理学委员会的相关规定并获得批准。

1.1.2组织芯片的构建

本研究共构建了两个独立的组织芯片(Tissue microarrays，TMAs)(肺腺癌)。两名病理专家独立筛选苏木精-伊红染色(HE)的切片，以验证肺腺癌和结直肠癌的诊断。每个样本选择最具代表性的肿瘤和非癌区域直径为1.5mm的组织，排列后制成肺腺癌的石蜡块，然后被切成4μm的切片。

1.1.3免疫组化检测HHLA2蛋白的表达

4μm的组织芯片常规烤片、脱蜡和水化后，进行抗原修复：采用柠檬酸盐缓冲液微波修复，室温自然冷却30min，自来水冲洗，ddH2O清洗3×2min，TBST缓冲液洗涤3×2min；用免疫组化笔画圈，然后滴加封闭液，室温湿盒中孵育20min；根据预实验结果，滴加用抗体稀释液稀释后的一抗(HHLA2 1:200，美国Abcam公司)，4°C湿盒孵育过夜；TBST缓冲液洗涤3×2min；滴加DAKO即用型二抗，然后放入37°C湿盒中孵育40min；TBST缓冲液洗涤3×2min；滴加DAB稀释液(1∶50稀释，DAKO公司)，显微镜观察显色情况，反应充分后自来水冲洗终止显色；苏木素复染，自来水返蓝，脱水，透明和封片，显微镜观察评估并拍照保存。

1.1.4免疫组化染色结果判断

根据阳性区域(Positive area，AP)和染色强度(Staining intensity，IS)，半定量法分别评价HHLA2在免疫细胞和肿瘤细胞中的表达。阳性区域被分为：0(AP:0%～5%)，1 (AP: 5%～25%)， 2 (AP:26%～50%)， 3 (AP:51%～75%)，4(AP:>75%)。染色强度被定义为：0(阴性)，1(弱)，2(中等)，3(强)。HHLA2表达式计算基于方程：强度分布(intensity distribution，ID)=阳性区域(AP)×染色强度(IS)[2]。因此，高评分的标准为：在肿瘤细胞表达>9，在免疫细胞>1。

1.2统计学分析

用SPSS20.0进行所有数据的分析。采用χ2检验或Fisher精确检验进行分析HHLA2的表达与临床病理参数之间的相关性，以P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1在肺腺癌中HHLA2的表达模式

本研究检测到HHLA2在大多数人肺腺癌中广泛表达，具有明显的空间分布规律，HHLA2主要定位于肿瘤细胞和免疫细胞的细胞膜和细胞质中，在肿瘤细胞中尤为明显。在邻近的癌旁组织中， HHLA2在肺组织的上皮细胞和基质细胞中均有轻微表达。显然，HHLA2在肿瘤组织中的免疫组化染色强度显著高于癌旁组织(P<0.05)。根据诊断阈值，在肺腺癌组织中，HHLA2高表达于77.0%(n=57)的免疫细胞和14.9%(n=11)的肿瘤细胞中。

2.2HHLA2在肺腺癌中表达的临床病理意义

采用了χ2检验研究HHLA2表达与肺腺癌临床病理特征的关系，在肺腺癌患者中，HHLA2在肿瘤细胞中的表达与临床病理参数均无关(P>0.05)。

表1 HHLA2表达水平与肺腺癌临床病理参数的关系

参数nHHLA2Low[n(%)]High[n(%)]P性别男4235(47.3)7(9.5)女3228(37.8)4(5.4)0.866年龄≤645751(68.9)6(8.1)>641712(16.2)5(6.8)0.055浸润深度(T)T1,T26757(77.0)10(13.5)T3,T476(8.1)1(1.4)1.000淋巴结转移(N)N04740(54.1)7(9.5)N1,N22723(31.1)4(5.4)1.000TNM阶段I,II4336(48.6)7(9.5)III3127(36.5)4(5.4)0.943吸烟史有3125(33.8)6(8.1)无4338(51.4)5(6.8)0.357

3 讨论

癌症是一个可怕的全球医疗负担，预计2019年全球将有超过1,810万例新确诊癌症病例和960万例癌症相关死亡病例。引人注目的是，肺癌、女性乳腺癌和结直肠癌是极其主要的恶性肿瘤，约占全球发病率和死亡率的1/3[1]。在过去的几十年里，免疫检查点疗法显著地改变了癌症治疗领域，就肺癌方面而言，美国FDA已经批准PD-1/PD-L1抑制剂作为一线或二线治疗[7]。

随着免疫检查点疗法被强调为癌症患者的一种重要治疗策略，人们对新增加免疫检查点的兴趣大大增加。作为最近被确定的B7家族检查点，少数学者针对HHLA2及其在肺腺癌的免疫微环境中的作用进行了研究。据报道，与在癌组织中广泛表达不同，HHLA2在乳腺、肠道、胎盘、胆囊等正常组织中表达有限[6]。它在人单核细胞中表达，在B细胞中被诱导[8]。有研究已证实HHLA2可能通过与不同配体的相互作用来刺激或抑制T淋巴细胞的功能[6]。HHLA2可以减弱细胞因子的分泌，比如干扰素(interferon，IFN)-γ、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-5和IL-10等[5]。相反，HHLA2也可以通过依赖AKT磷酸化，与其中一个受体跨膜免疫球蛋白结构域2(TMIGD2)结合，共同刺激T细胞的增殖和细胞因子的产生[8]。

本研究评估了HHLA2在肺腺癌中的表达模式和临床意义，结果表明，HHLA2在肺腺癌中的表达显著高于非癌性肺组织。值得注意的是，本研究发现HHLA2有不同的表达模式，其在肺腺癌的肿瘤细胞和免疫细胞中均呈阳性染色，而在免疫细胞中尤为明显，但本研究并未发现HHLA2与肺腺癌临床病理参数的关系，可能与病例数较少有关。另外，HHLA2被报道了可以通过与不同的配体结合而发挥共抑制和共刺激活性。HHLA2的过表达可导致骨肉瘤和乳腺癌患者生存质量低下[6, 9]。但也有研究表明了HHLA2的共同刺激作用，其中HHLA2可以增强T细胞功能[8]，并对胃癌有良好的预后[10]。本研究认为HHLA2是肺腺癌潜在的免疫治疗靶点，可能具有克服抗PD-1/PD-L1免疫治疗获得性耐药的潜力，进一步的研究需要综合评价HHLA2的肿瘤异质性和免疫功能，以达到最佳的免疫检查点治疗效果。希望本研究能够有助于进一步探索针对这些B7家族检查点的临床试验，在设计最佳的联合免疫治疗方法中发挥重要作用。