人血清淀粉样蛋白A磁微粒化学发光免疫分析定量检测方法的建立及性能评价 *

丁蒙蒙，李 奎，于 林，李双法

(郑州安图生物工程股份有限公司，郑州 450016)

血清淀粉样蛋白A(human serum amyloid A，SAA)是1976年从血清中分离鉴定出的一类高度保守的急性期蛋白家族成员，也是一种存在于血浆中的脂结合蛋白[1]。通常被认为是炎症反应的主要蛋白之一[2]，人体内正常情况下SAA含量是极低的，在细菌或病毒感染时迅速升高。近年来的研究结果表明：SAA在细菌、病毒感染，慢性炎性(类风湿性关节炎、糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病)，肿瘤等疾病中均有升高，与传统的感染标志物外周血白细胞计数(peripheral blood white blood cell count，WBC)和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)相比，SAA的优势在于病毒感染期灵敏度高，升高时间较其他标志物早，而且升高幅度大[3]。因此在感染早期，SAA联合CRP检测，能提高鉴别细菌或病毒感染的可靠性[4-5]。目前用于检测SAA的方法主要有透射比浊法、散射比浊法、乳胶增强免疫比浊法和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoSorbent assay，ELISA)，关于磁微粒化学发光法未见报道，因此本研究旨在建立一种快速、准确检测SAA的磁微粒化学发光法，并对其检测性能进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取驻马店中心医院2018年5～10月疑似细菌或病毒感染患者300例，100例来自正常人体检样本。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：基因工程重组SAA抗原、抗SAA小鼠单克隆抗体对(SAA1，SAA2)购自郑州伊美诺生物技术有限公司；校准品稀释液为50 mmol/L pH 7.4 TB缓冲液，含有1 mg/dl Casein，0.2 ml/dl P-300；磁珠包被缓冲液为20 mmol/L pH 7.4 PBS缓冲液；封闭液为50 mmol/L pH 7.4 TBS缓冲液，含有2 mg/dl BSA，0.2 ml/dl P-300；对比试剂：西门子试剂盒，血清淀粉样蛋白A(散射比浊法)测定试剂盒；SAA国际标准品(NIBSC 92/680)购买自英国NIBSC公司。

1.2.2 主要仪器：Auto Lumo A2000 Plus全自动化学发光测定仪(郑州安图生物工程股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 双抗体夹心法抗体制备

1.3.1.1 包被抗体的制备：取磁珠包被缓冲液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反复吹打，置于磁珠分离器上吸取上清后，添加碳二亚胺活化液，室温反应30 min～1 h，然后加入鼠抗人SAA捕获抗体偶联2 h或过夜，偶联结束后，置于磁珠分离器上吸取上清，加入乙醇胺溶液进行封闭30 min，吸取上清后加入封保液，混匀后置于磁珠分离器，弃上清，重复3～5次后，最后加入封保液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.3.1.2 辣根过氧化物酶标记SAA抗体的制备：采用过碘酸钠法标记SAA抗体并用半饱和硫酸铵法纯化并透析，取上清加入50ml/dl甘油于-20℃保存。

1.3.2 SAA校准品的制备：使用校准品稀释液稀释SAA国际参考品(NIBSC 92/680)，浓度分别为200，100，50，25，5mg/L，校准品稀释液为0 mg/L，同时SAA校准品高点浓度为200 mg/L。

1.3.3 试剂盒的性能指标

1.3.3.1 空白限：准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，连续测定4天，按照CLSI EP17-A2的方法进行结果分析，计算空白限。

1.3.3.2 精密度：

1.3.3.2.1 分析内变异：分析内变异是指在同一次分析测定中测定结果的变异情况。按照CLSI EP5-A2的方法分别准备临床精密度样本高、中、低浓度三份，各重复测定20次，计算分析内变异。

1.3.3.2.2 分析间变异：分析间变异(也叫天间变异)是指在不同次的分析测定中测定结果的变异情况。按照CLSI EP5-A2的方法，制备临床精密度样本高、中、低浓度3份，每天各检测2次，每次2个重复，连续检测20天，计算分析间变异。

1.3.3.3 线性：根据CLSI EP06-A文件进行线性范围的建立。具体方法如下：准备10份浓度约为300 mg/L的临床高值样本和1份浓度接近于0的临床低值样本按照不同比例混合，制备出10组系列浓度的样本，作为线性样本进行测定，计算线性范围。

1.3.3.4 准确度：用标准品稀释液稀释国际标准品，稀释到线性范围内的3个浓度样本。每个样本重复检测2次，计算每个样本检测浓度与理论浓度的偏差。

1.3.3.5 回收率：根据CLSI EP09文件进行试剂盒的回收率评估。具体方法如下：选择高值样本3份，按照1∶9的比例分别加入到3份低值样本/基质样本中，制成回收样本，加入高值样本的体积不得超过总体积的10%，每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。回收率R=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% ，其中V0为低值样本的体积，VS为高值样本的体积，C为回收样本的检测浓度，C0为低值样本的检测浓度，CS为高值样本的检测浓度。

1.3.3.6 钩状效应：将SAA抗原加入SAA校准品稀释液中，配制成系列梯度HOOK样本(理论浓度分别为10 000，8 000，4 000，2 000 mg/L)进行测定。

1.3.3.7 方法学比对：根据CLSI EP09-A2文件，与对比试剂均在相同条件下进行平行检测，具体方法如下：分别用本文方法和西门子检测系统(散射比浊法)同时进行检测，每份样本重复3次检测，计算均值，并进行线性拟合和统计学分析。

1.4 统计学分析 线性拟合采用Excel软件进行，性能评价按照EP文件的实验要求，实验结果采用SPSS20.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 空白限 对得到的60个数据进行分析，该检测方法的空白限为0.1 mg/L。

2.2 精密度 见表1。该方法学的分析内精密度均不高于5%，分析间精密度不高于10%。

2.3 线性 10组回归方程的相关系数r均大于0.990，10组样本中每个样本的实际测得浓度与理论浓度的相对偏差均小于2%，因此本研究建立的SAA检测方法的线性范围为2～200 mg/L。

2.4 准确度 用标准品稀释液稀释国际标准品，得到线性范围内的3个浓度样本。3个稀释样本的实测浓度与理论浓度的偏差分别为5.18%，4.94%和6.64%，其偏差均小于试剂盒允许偏倚15%。

2.5 回收率 见表2。10个样本的回收率在95%～114%之间，符合要求。

表1 分析内、分析间精密度检测结果

表2 回收率的测定(mg/L)

2.6 钩状效应 对浓度为10 000 mg/L的样本进行测定，结果显示其信号值回算的浓度值均大于200 mg/L，说明采用本方法学检测，样本中SAA浓度高达10 000 mg/L时，未出现钩状效应。

2.7 方法学比对 两种方法同时检测100例临床血清(其中60例为细菌或病毒感染患者血清，40例为正常人血清)进行SAA测定，以西门子试剂SAA检测值为X轴，以安图磁微粒化学发光试剂SAA检测值为Y轴，线性回归方程为：Y=1.099 8X-2.673 9，相关系数(r2)为0.983 4，见图1。

图1 相关性拟合曲线

3 讨论

SAA属于一种急性时相反应蛋白，人体中主要在肝脏中合成，在急性时相反应中，由白细胞介素1(interleukin，IL-1)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α) 刺激诱导产生，这些细胞因子可以与糖皮质激素协同作用以增强SAA的产生[6]。SAA是反映感染性疾病早期炎症的重要指标，在炎症或感染急性期48～72 h内迅速升高，并在疾病的恢复期下降，与CRP相比，具有更高的敏感性[7]。现有的研究结果表明，SAA参与了多种疾病如心脑血管疾病、细菌、病毒感染、动脉粥样硬化、冠心病、急性移植排斥反应、肿瘤、类风湿性关节炎等，并在疾病的发生和发展中起着重要的作用。因此，SAA磁微粒化学发光法的建立具有重要的意义。

SAA检测方法主要包括免疫比浊法、胶体金法、ELISA，荧光层析法等[8]。免疫比浊法由于仪器的要求高以及原理的缺陷，造成免疫比浊法的检测结果线性短，检测结果不准确，而且易受血脂的影响。胶体金法适用于床旁检验，并且可以检测全血，但该方法不利于样本批量处理。ELISA测定具有较高的灵敏度，但操作过程繁琐，每次测值均需要绘制标准曲线，准确度误差大，测定时间较长，仪器昂贵且需要经过一定专业培训的人员进行操作。化学发光法作为新一代标记免疫测定方法具有高灵敏度、高精密性、易操作等优点，可以很好地满足临床科室对感染性疾病快速、准确诊断的需求。

本研究采用磁微粒化学发光免疫检测法，基于双抗夹心法原理，搭配全自动免疫检测仪，灵敏度高、精密度好、线性范围宽、临床相关性好，具有一定的临床应用价值。