Dole qPCR检测嗜肺巴斯德杆菌的可靠性研究及在啮齿类实验动物质量监测中的应用 *

王立鹏，李永旺，王晨娟，杨玲焰

(苏州西山生物技术有限公司，江苏苏州 215123)

嗜肺巴斯德杆菌(pasteurellapneumotropica，PP)，属于巴斯德杆菌科，是一种革兰氏阴性、不运动、无芽孢的短杆菌或球杆菌，是啮齿类实验动物感染率最高的病原菌之一[1]，它有两种生物型，即 “Heyl”型和“Jawetz”型(简称H型和J型)[2]。在实验动物中，嗜肺巴斯德杆菌是一种条件致病菌，主要感染咽、气管、肺、子宫、眼部以及肠道等器官，对免疫功能健全的动物一般不会影响健康状态，但感染免疫缺陷动物后会引起疾病发作甚至死亡。嗜肺巴斯德杆菌被认为是感染啮齿类实验动物最重要的巴斯德菌科细菌[3]，是国际上和我国国标SPF级啮齿类实验动物必须排除的病原菌之一[4]。

嗜肺巴斯德杆菌实验室诊断方法有细菌分离培养及生化鉴定和PCR检测方法，我国国标要求的诊断方法是分离培养后生化和血清学鉴定(凝集试验)[5]。细菌分离及生化鉴定费时、操作繁琐且敏感度低；PCR方法虽然对实验条件要求高，但因快速、敏感且特异度强，已成为实验动物质量检测的重要方法。本研究拟用本公司保存的标准菌株和分离菌株对文献中报道的四种PCR方法进行敏感度和特异度比较，选择最佳方法应用于临床气管和肠内容物两种样本检测，并和传统生化鉴定进行综合比较，确立适用于啮齿类实验动物健康监测中嗜肺巴斯德杆菌的检测方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 实验动物：来源于2015年不同机构送检的191只SPF级或清洁级小鼠，57只SPF级或清洁级大鼠和64只清洁级沙鼠，来自全国22个不同厂家的312只实验动物，均活体运输至本公司，在人道处死后，在生物安全柜内按无菌操作采集气管和肠内容物拭子以及相应组织。

1.1.2 标准菌株：标准菌株嗜肺巴斯德杆菌J型ATCC 35149，嗜肺巴斯德杆菌H型ATCC 12555，多杀巴斯德杆菌CVCC458等17种菌株购自广东微生物菌种保藏中心、ATCC全球生物资源中心等，均-70℃保存于本实验室。

1.2 试剂和仪器 生物安全柜为上海力申科学仪器有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；生化鉴定仪为生物梅里埃公司ATB1525 Expression系统；所有引物均由苏州金唯智生物技术有限公司合成；10×buffer(含Mg2+)，dNTP Mixture，rTaq DNA聚合酶，2×Premix Ex Taq(Probe)，ROX(50×)均为日本Takara公司产品；PCR仪为Eppendorf公司产品；荧光定量7500 PCR仪(Applied Biosystyem，美国)；凝胶成像分析仪Genosens1560为上海勤翔科学仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：动物无菌暴露后切下气管(约5 mm)并放置于含100 μl无菌水的无菌管中充分震荡漂洗，用无菌棉签蘸取漂洗液后划平板培养[6]。暴露结肠回盲部，用无菌剪刀剪开盲肠壁，用两支无菌棉签在无菌水中湿润后蘸取回盲内容物少许用于划板培养，另外取绿豆大小(约50 mg)肠内容物置于无菌管中用于核酸检测。气管和肠内容物置于-20℃保存待用。

1.3.2 细菌分离及生化鉴定：严格按照实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法GB/T 14926.12-2001进行，将各动物的气管拭子或肠内容物拭子在含5 ml/dl脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂平皿(血平板)上划线涂布，36±1℃培养18～24 h后，观察菌落大小、颜色和形态等，挑取灰白色或黄色露滴样可疑菌落于血平板上三区划线分纯，36±1℃培养18～24 h，并对分纯后的可疑菌落进行革兰氏染色，确认为革兰氏阴性的小杆菌，再挑取此菌进行生化鉴定。

1.3.3 DNA提取：根据细菌基因组DNA提取试剂盒提取标准菌株核酸，用于PCR方法的敏感度和特异度测试。取各动物的气管(约5 mm)和肠内容物样本(约50 mg)，操作严格按照试剂盒说明书提取核酸，-20℃保存待用。

1.3.4 引物合成：嗜肺巴斯德杆菌PCR检测方法有Dole qPCR，qPCR和Benga PCR三种方法，其中Dole qPCR与Benga mPCR可以分型；另有Bootz普通PCR方法为巴斯德科通用引物。引物见表1。

1.3.5 普通PCR反应：程序参考Benga和Bootz设计的方法。反应体系为25 μl，含10×buffer(含 Mg2+)2.5 μl，dNTP Mixture 2 μl，上下游引物各0.5 μl，0.2 μl rTaq DNA聚合酶，5 μl DNA模板和ddH2O 14.3 μl。在PCR仪中95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s(Bootz法退火温度55℃；Benga法为58℃)，72℃延伸30 s，进行35个循环；之后72℃继续延伸7 min。16s rDNA 程序为94℃预变性5 min；94℃变性45 s， 55℃退火45 s， 72℃延伸90 s，进行35个循环；72℃延伸7 min。1.5 mg/dl琼脂糖凝胶电泳，电压为5 V/cm，由凝胶成像分析仪采集电泳结果。每次实验中，均设置质粒阳性对照和空白对照。PCR产物送交苏州金唯智生物技术有限公司进一步测序，对测序结果通过NCBI数据库比对。

1.3.6 荧光定量PCR反应：反应程序分别参考DOLE等[7]和高正琴等[8]设计的方法。反应体系为20 μl，含2×Premix Ex Taq(Probe)10 μl，ROX(50×)0.4 μl，上下游引物各0.2 μl，探针0.2 μl，5 μl DNA模板和ddH2O 4 μl。在荧光定量7500 PCR仪中95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸31 s(采集信号)，进行40个循环。

1.4 统计学分析 在同一试验中每个稀释度标准品(J型菌株核酸)做3个复孔，以分析组内差异。通过统计计算循环阈值(threshold cycle，Ct)、相对标准偏差 (relative standard deviation，RSD)，验证该方法的稳定性。

2 结果

表1 巴斯德菌科，嗜肺巴斯德杆菌以及16s rRNA引物序列

2.1 四种PCR方法的敏感度和特异度比较 以J型标准菌株(ATCC 35149)DNA为模板(3.2×109CFU/ml)，10倍梯度稀释后分别用于Dole qPCR，Gao qPCR，Benga mPCR and Bootz PCR方法的敏感度实验，Bootz PCR和Benga普通PCR检测下限分别为3.2×103CFU/ml和3.2×105CFU/ml(Bootz PCR的特异性目的片段大小为533 bp；Benga mPCR的方法J型目的片段大小为326 bp，H型为451 bp)；而Dole PCR与高正琴qPCR方法敏感度都高达320 CFU/ml。高正琴qPCRCt值组内重复测定RSD值在0.06%～0.38%之间，Dole qPCRCt值在0.20%～1.15%之间，均在可接受的合理范围内。两对普通PCR引物是巴斯德菌科引物，虽能检出H型和J型，但也能检出巴斯德菌科其他细菌，如：多杀巴斯德杆菌和小鼠放线杆菌；Dole qPCR法特异度较强，且对H型和J型PP分型。而高正琴qPCR方法虽敏感度较高，但也能扩增大肠埃希菌、沙门氏菌、假结核耶尔森菌等多种非巴斯德杆菌科细菌，由于该引物特异度较低，因此后续试验中不再采用，4种PCR方法的特异度测试结果见表2。

表2 嗜肺巴斯德杆菌4种PCR的特异度比较

注：-：PCR阴性；+：PCR阳性。

2.2 疑似嗜肺巴斯德杆菌分离菌株鉴定 用Bootz，Dole和Benga三种PCR方法及ATB生化鉴定法对本实验室分离留存的76株嗜肺巴斯德杆菌可疑菌进行检测比较，见表3。

表33种PCR方法与培养法对76株嗜肺巴斯德杆菌疑似菌株的检测结果

PCR鉴定方法 培养法阳性数阴性数总数Dole qPCR Benga mPCR Bootz PCR 阳性数阴性数阳性数阴性数阳性数阴性数5196006001511601606610760760

ATB生化鉴定60株为嗜肺巴斯德杆菌(阳性率为78.9%)，但76株可疑菌用Benga mPCR法和Bootz普通PCR法检测均为阳性(阳性率均为100%)，Dole qPCR方法检出66株嗜肺巴斯德杆菌(阳性率86.8%，66/76)，34个H型和32个J型，且与Benga mPCR法的分型结果一致，表明培养的可疑菌株中存在巴斯德菌科中其它菌。10株Dole qPCR阴性的分离菌株用ATB鉴定有9株为嗜肺巴斯德杆菌(其中8株分离自大鼠，1株源于小鼠)，1株阴性(源于仓鼠的分离株)，这10株疑似菌株经16S rRNA测序分析表明这些菌株虽为巴斯德菌科细菌，但不是嗜肺巴斯德杆菌，无法确定种属。

2.3 样本中嗜肺巴斯德杆菌的检测 小鼠、大鼠和沙鼠的气管和肠内容物拭子培养分离细菌后生化鉴定，或从样本中直接提取核酸后用高度敏感、特异的Dole qPCR进行检测，结果见表4。这三种动物用细菌分离与生化鉴定法检测，气管中阳性率分别为4.2%，15.8%和18.8%，肠内容物中阳性率为0.5%，0%和4.7%。Dole qPCR法检测上述3种啮齿动物中嗜肺巴斯德杆菌，气管中阳性率分别为25.7%，28.1%和26.6%，肠内容物中阳性率分别为27.2%，29.8%和21.9%。小鼠、大鼠和沙鼠的PCR总阳性率(气管和/或肠内容物阳性)分别为39.3%，35.1%和34.4%，而传统分离培养方法检出率仅为4.7%，15.8%和23.4%。Dole qPCR PP检出率显著高于国标要求的细菌分离及生化鉴定法。

表4 不同方法检测三种啮齿动物的气管和肠内容物中嗜肺巴斯德杆菌阳性率比较[n(%)]

3 讨论

现行国标中嗜肺巴斯德杆菌的检测方法(GB/T 14926.12-2001)仍为分离培养后生化结合血清学(凝集试验)鉴定，可疑菌落必须进行生化鉴定，目前生化鉴定试剂大多采用商业试剂盒，鉴定结果通过计算机处理、判定，根据判定值，得出相应的鉴定结果。本公司采用的是ATB1525 Expression系统对76株PP可疑菌株进行生化项鉴定，鉴定结果为阳性60株(其中9株经PCR方法鉴定为巴斯德菌科细菌)，阴性16株(其中15株经PCR方法鉴定为假阴性)，说明ATB1525 Expression系统鉴定嗜肺巴斯德杆菌(包含d-甘露醇、海藻糖、β-葡萄糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、肌醇、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、尿素酶、α-半乳糖苷酶等)还不能完全区分巴斯德菌科内其它菌种，需要增加更多项生化指标，如吲哚、甘露醇、蜜二糖、棉子糖、甘油、糊精等[12]，另外菌株对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性也可作为鉴定嗜肺巴斯德杆菌的指标。

目前，文献中有多个嗜肺巴斯德杆菌PCR方法的报道。2009年BOOT等[13]报道的Bootz PCR方法适于检测巴斯德菌科细菌，且敏感度较高。2010年Dole设计了qPCR方法，针对H和J型两种菌株16S rRNA分别设计检测探针，达到区分嗜肺巴斯德杆菌两种生物型的目的。2012年高正琴等[8]报道了一种新的嗜肺巴斯德杆菌qPCR方法，具有很高的敏感度，检测灵敏度达22 copies/μl，并可用于啮齿类实验动物气管样本直接检测，而不需先培养分离。2013年BENGA等[9]设计的4重PCR(mPCR)可对嗜肺巴斯德杆菌分型，同时能检出非PP的巴斯德菌科细菌。我们以嗜肺巴斯德杆菌标准菌株和分离菌株对BOOTZ(1998)，DOLE(2010)，高正琴(2012)和BENGA(2013)4种PCR方法进行了验证，高正琴等[8](2012)报道的qPCR方法虽然敏感度很高，但特异度较差，通过DNAMAN软件进行序列分析，发现该方法使用的引物和探针不特异，与我们实验结果相符。2014年，邢进等[14]对306株嗜肺巴斯德杆菌可疑菌株的16S rDNA测序确认有74.2%(227株)为嗜肺巴斯德杆菌，用BD自动生化鉴定仪鉴定的阳性率为53.6%，也反映了生化鉴定的局限性，与我们生化鉴定方法结果一致。他们也使用了Benga mPCR法(2013)，可检出所有嗜肺巴斯德杆菌，其中有8.4%(19株)Benga mPCR阳性但不能分型，提示该方法同时可检出非PP的巴斯德菌科细菌。我们以3种PCR方法和ATB生化鉴定法对76株本室分离的PP可疑菌进行鉴定，结果表明PCR阳性率显著高于生化鉴定ATB法，与邢进等[14]报道一致。我们用Benga mPCR与Bootz普通PCR检测也发现这两种方法不能将嗜肺巴斯德杆菌与巴斯德菌科其它细菌相区分，不适于PP可疑菌株的鉴定，且敏感度较低。相比之下Dole qPCR的灵敏度更高且可达到H型和J型分型的目的，因此Dole qPCR更适于PP 可疑分离株的核酸鉴定。

我国国标要求SPF级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、沙鼠等啮齿类实验动物必须排除嗜肺巴斯德杆菌。国内外的嗜肺巴斯德杆菌检测一般均以咽和气管为样本，而对肠道中嗜肺巴斯德杆菌感染情况调查甚少。小鼠和大鼠肠内容物的嗜肺巴斯德杆菌PCR阳性检出率均高于气管，虽然沙鼠肠内容物阳性检出率略低于气管，提示采集粪便用qPCR检测不失为嗜肺巴斯德杆菌日常监测的可行方法，特别是珍贵动物必须活体采样时。当然单一样本的qPCR检测均会产生一定漏检，同时使用气管和肠内容物样本可以更精准的反映嗜肺巴斯德杆菌的携带或感染状况。

我们对国内多家机构提供的SPF级小鼠和大鼠，分别以细菌分离培养生化鉴定法和组织提取核酸PCR法进行检测，后者不仅检出培养法所有的阳性样本，而且直接qPCR检测样本阳性检出率远高于培养法，可替代ATB鉴定方法。

2017年，嗜肺巴斯德杆菌和亲缘性相近的啮齿类巴斯德菌科细菌被重新归类为新的啮齿类杆菌属(rodentibacter)，该属包括8个不同的菌种，其中嗜肺巴斯德杆菌的Heyl和Jawetz生物型分别被定义为啮齿杆菌H型(rodentibacter heylii，R. heylii)和嗜肺啮齿杆菌(rodentibacter pneumotropicus，R.pneumotropicus)[12]。因此Dole qPCR方法应用于啮齿类实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测不受分类改变的影响。

总之，Dole qPCR方法直接检测组织样本比传统的培养分离后生化鉴定方法的敏感度和特异度均大大提高，同时检测气管和肠内容物可显著提高嗜肺巴斯德杆菌的阳性检出率。对需保留活体的珍贵啮齿类品种采集粪便使用qPCR检测不失为有效、可行的嗜肺巴斯德杆菌监测手段。我国实验动物中嗜肺巴斯德杆菌的感染率长期被严重低估，我们推荐将Dole qPCR方法列入我国嗜肺巴斯德杆菌的检测国标或团标，以便于更有效监测并及时控制、清除该菌。