斑马鱼hoxb7a基因在hox基因簇中的作用研究

孟祥丽， 白金尊， 张绪帅， 李伟明， 祖 尧

(1．上海海洋大学科技部海洋生物科学国际联合研究中心， 上海 201306；2．上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室， 上海 201306； 3．上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心， 上海 201306)

Hox基因(Homebox gene)是编码具有同源框的一大类转录因子家族，全名同源异型基因，在动物身体形态构建过程中发挥重要作用[1]。Hox基因无论大小，其序列中均含有一段由180～183个碱基组成的保守序列，该序列编码60～61个氨基酸所构成的多肽区域，称为同源结构域( homeodomain，HD)[2]。Hox基因有在染色体上成簇排列的特点，并且最早Hox基因在果蝇中被发现，而果蝇中只含有一个基因簇[3]。大多数脊椎动物在进化过程中经历了基因组加倍，Hox基因在这个过程中也发生了加倍。如无颌类的海七鳃鳗有两个Hox基因簇[4]；大多数有颌类，包括人在内的哺乳动物，经历了两次全基因组加倍，具有4个Hox基因簇，小鼠中Hox基因簇分别命名为HoxA、HoxB、HoxC和HoxD[5]，总共有39个Hox基因[6-7]。大多数硬骨鱼包括模式动物斑马鱼经历了额外的一次基因组加倍，最终形成7～8个基因簇。在斑马鱼中含有7个hox基因簇，共有48个基因[8-9]。斑马鱼hoxb7a在hoxba基因簇的中间位置，并且其在第7旁系同源组的同源基因在进化过程中丢失，所以hoxb7a成为hox基因簇第7同源组中仅存的基因。因此，没有因为基因组加倍而产生冗余基因影响的hoxb7a，是探索hox单基因在hox基因簇中作用很好的候选基因。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repects/CRISPR-associated proteins，成簇的规律性间隔的短回文重复序列及相关的核酸内切酶)系统是继TALENs(transcription activator-like(TAL)effector nucleases)[10]、ZFN(zinc finger nuclease)之后更方便高效的基因编辑系统[11]。CRISPR/Cas9系统具有操作简单、成本低等优势，目前已经被广泛应用于多种模式生物中[12]。斑马鱼(Danio rerio)是一种小型热带鱼类，体长3～4 cm，具有易饲养，产卵量大，生殖周期短，胚胎体外发育，便于观察等优势，是研究基因功能的理想模式生物。

为了研究hoxb7a在hox基因簇中的作用，作者利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中构建了hoxb7a基因的突变体。通过检测其他hox基因在hoxb7a突变体中的表达量变化，初步探究了hoxb7a在整个hox基因簇中发挥的作用，期望为hoxb7a基因功能机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 斑马鱼的来源与饲养

本实验所用野生型斑马鱼均为AB品系，养殖水温为28.5 ℃。本实验室提供设备完善的斑马鱼鱼房，且提供专门为斑马鱼产卵的产卵缸。斑马鱼生活在经过UV及曝气处理过的循环系统，水温为28.5 ℃。斑马鱼产卵后将鱼卵收集后放于28.5 ℃的恒温培养箱培养。对斑马鱼的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照上海海洋大学动物伦理相关规定进行(IACUC 20171009)。

1.1.2 仪器及试剂

本实验所用主要仪器包括常规PCR仪(Bio-Rad公司)、荧光定量PCR仪(罗氏公司)、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)等。主要试剂包括Taq酶(全式金公司)、体外转录试剂盒(Life Technologies)、感受态细胞(天根公司)及荧光定量检测试剂盒(罗氏公司)等。

1.1.3 质粒来源

实验所用的体外合成Cas9 mRNA质粒由北京大学生命科学学院张博教授赠予。实验所用的体外合成gRNA pUC19-scaffold plasmid由北京大学分子医学研究所熊敬维教授实验室赠予。

1.2 方法

1.2.1 设计敲除靶点及检测引物

采用Ensembl网站(http://ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)中斑马鱼hoxb7a基因序列，通过Cas9靶点预测网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)设计hoxb7a的gRNA靶位点为GGCTACGGCTCGGCTTCAAC。靶位点经NCBI网站检测特异性后，设计检测引物，上游引物为ATTGTATTATGCGAACGCGCTG；下游引物为TTGATGGTAGCCCCTCTGCT。

1.2.2 CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼hoxb7a基因

体外转录合成hoxb7agRNA 和Cas9 mRNA, 将Cas9 mRNA和gRNA按一定的比例配成混合液，Cas9 mRNA 300～600 pg，gRNA 80～100 pg，将混合液注射到斑马鱼一细胞期动物极中。48 hpf取胚胎进行T7E1酶切检测。将酶切检测为阳性的胚胎养至成鱼为F0。

1.2.3 获得hoxb7a纯合突变斑马鱼

将F0养至成鱼，与野生型斑马鱼外交筛选获得可遗传的F0。并将可遗传的F0外交所得的F1养至成鱼。F1内交筛选获得F2纯合突变体。

1.2.4 QPCR 检测基因表达情况

收集 48 hpf的hoxb7a-/-和野生型斑马鱼各 30 尾，提取 RNA，反转录成 cDNA。每个样品做3次技术重复，每个基因做3个生物学重复，采用表1中引物，进行QPCR检测。

表1 QPCR引物序列

2 结果与分析

2.1 斑马鱼hoxb7a的进化地位

斑马鱼中含有7个hox基因簇，分别命名为：hoxaa、hoxab、hoxba、hoxbb、hoxca、hoxcb和hoxd(图1-A)。斑马鱼hoxb7a基因是进化过程中第7旁系同源组中仅存的基因。人和小鼠中有HOXA7(Hoxa7)和HOXB7(Hoxb7)，非洲爪蟾中有HoxB7A和HoxB7B。我们对斑马鱼hoxb7a基因和其他物种hoxB7基因进行了同源性比对，构建进化树分析。结果显示，斑马鱼hoxb7a与辐鳍鱼纲金钱鱼科金钱鱼和硬骨鱼纲鲤科鱼类鲤鱼hoxb7a聚为一支，有较高的同源性，同源性分别高达96%和94%(图1-B)。而与哺乳类的人和小鼠，两栖类的非洲爪蟾同源性较低。

2.2 利用CRISPR/Cas9技术成功编辑斑马鱼hoxb7a基因

斑马鱼hoxb7a共有2个外显子，我们在斑马鱼hoxb7a第1个外显子上设计Cas9敲除靶位点(图2-A)，将Cas9 mRNA和hoxb7agRNA共注射入斑马鱼一细胞期动物极中，48 hpf后提取基因组，PCR扩增出目的片段，利用T7E1酶切检测敲除情况。结果显示，hoxb7agRNA成功编辑靶位点，T7E1酶切成功(图2-B)突变效率平均为43%。同时，我们将PCR产物进行测序验证，测序峰图也显示在靶位点位置出现乱峰，表明对hoxb7a基因敲除成功(图2-C)。

图1 斑马鱼hoxb7a基因的进化地位

图2 利用CRISPR/Cas9系统编辑斑马鱼hoxb7a基因

2.3 成功获得斑马鱼hoxb7a纯合突变体

我们将检测hoxb7a敲除成功的斑马鱼胚胎养至成鱼，进一步筛选敲除成功的斑马鱼从而获得可遗传的F0，将F0外交获得F1杂合突变体。通过对F1hoxb7a+/-进行基因型鉴定，我们成功获得两种基因突变类型：hoxb7a+/-基因缺失 8 个碱基(Δ8 bp)，图3-A和缺失23 个碱基(Δ23 bp)，图3-B，并且两种突变类型都出现了移码突变，提前产生了终止密码子。我们将hoxb7a+/-F1内交获得F2，通过对F2剪尾进行基因型鉴定，成功检测得到两个等位基因同时突变的hoxb7a纯合突变体。

*代表出现终止密码子

图3斑马鱼hoxb7a两种突变类型

Figure 3 The two mutant fish lines of zebrafishhoxb7a

2.4 斑马鱼hoxb7a基因缺失导致基因簇中相邻hox基因表达量上调

斑马鱼基因组在进化过程中发生了加倍，而hox基因簇中第7旁系同源组基因在进化过程中产生了基因的丢失，最终在hox第7同源组基因中只保留了hoxb7a一个基因。本文探究hoxb7a缺失后hoxb基因簇的其他基因成员表达量是否受到影响。我们在斑马鱼胚胎发育48 hpf分别提取野生型和hoxb7a突变体RNA，并反转录成cDNA，利用QPCR检测hoxb基因簇中其他基因的表达量变化。我们首先选择了hoxba基因簇中距离hoxb7a较远的hoxb1a和hoxb10a及hoxb7a两侧的hox基因进行了QPCR实验。结果显示距离hoxb7a较远的hoxb1a和hoxb10a基因在hoxb7a突变体中表达量变化不明显(P>0.05)。而在hoxb7a两侧的基因中除hoxb8a表达量出现了显著性的升高外(P<0.001)，其他几个基因表达量变化同样不明显(P>0.05)，图4-A。这引起了我们的关注去进一步检测hoxbb基因簇中相关hox基因的表达量变化。

图4 斑马鱼hoxb7a突变体中相关hox基因表达量变化

hoxbb基因簇是hoxb基因簇进化中加倍后产生的另一基因簇，我们选取了hoxbb基因簇中的基因进行了检测。结果显示，hoxb1b(P>0.01)，hoxb8b(P>0.05)在hoxb7a突变体中表达量变化不明显，hoxb5b和hoxb6b两个基因表达量显著升高(P<0.001)(图4-B)。综上，我们发现，在基因簇中距离hoxb7a较远的基因hoxb1a、hoxb1b、hoxb10a受hoxb7a影响不明显。而在基因组上靠近hoxb7a的基因hoxb5、hoxb6、hoxb8受到了hoxb7a的调控，并且进化过程中加倍的两个基因中只有一个基因受到调控，分别是hoxb5b、hoxb6b、hoxb8a。

此外，我们还选择了hoxa基因簇中的hoxa9a进行了检测。QPCR结果显示，hoxa9a基因在hoxb7a突变体中表达量上调(P<0.001)，表明hoxb7a不仅作用于hoxb基因簇，和其他基因簇基因也具有一定的相互调控关系。

3 讨论

Hox基因在进化过程中的加倍，使得加倍的基因在功能上分化更加精细，旁系同源基因之间相互作用共同调控机体发育。在小鼠中，Hoxa基因簇和Hoxb基因簇共同作用使得颅面存在多样性，Hoxb基因簇缺失可以增强单个Hoxa基因簇缺失导致的缺陷表型[13]。此外，在心脏器官发育过程中，Hoxa和Hoxb基因簇也存在相互作用。2013年Soshnikova等人报道缺失单个Hoxa或Hoxb基因簇心脏未出现明显表型。但当两个基因簇同时缺失时，心脏环化明显异常[14]，这体现了加倍的Hox基因簇之间的相互作用。同样单个Hox基因与其旁系同源基因间也存在相互作用，例如小鼠中Hoxa1和Hoxb1共同调控心脏流出道的发育[15-16]，斑马鱼中hoxb1a和hoxb1b相互作用共同调控菱脑节的发育[17]。

斑马鱼hoxb7a在进化过程中其纵向旁系同源基因丢失，且位置处于基因簇的中间(图1-A)，这使得研究hoxb7a在基因簇中的作用变得尤为重要。本实验利用CRISPR/Cas9技术将斑马鱼hox基因簇中比较特异的hoxb7a基因进行了敲除，并成功筛选获得F2纯合突变体。在hoxb7a纯合突变体中我们检测了hoxb基因簇其他hox基因成员mRNA水平的变化。QPCR结果表明：hoxb7a基因突变后仅引起邻近旁系冗余hox基因(hoxb5b、hoxb5a、hoxb6a、hoxb6b、hoxb8a、hoxb8b)中的一个基因上调，例如在hoxb7a突变体中仅hoxb5b、hoxb6b、hoxb8a基因受到影响。这暗示在旁系同源组中仅存的hoxb7a基因调控功能比较重要，而加倍后的冗余hox基因功能出现分化。

关于hoxb7a的突变体，目前还没有文献报道。对于hoxb7a的基因功能已有一些初步的研究，2015年Rochtus等人报道hoxb7a敲降后斑马鱼发育迟缓，色素衰减。当过表达不同浓度hoxb7amRNA后，斑马鱼神经系统发生不同程度的紊乱，这说明hoxb7a基因在神经发育过程中发挥作用[18]。另外，也有文献报道，hoxb7a和hoxa9a可以补救cdx4基因缺失导致的血管缺陷，这说明hoxb7a在血管发育过程中也发挥重要作用[19]。我们在hoxb7a突变体中检测hoxa9a的表达量变化，发现hoxb7a缺失后，hoxa9a表达量显著升高，这也初步显示hoxb7a和hoxa9a基因之间存在着一定的相互调控关系。本研究成功构建了hoxb7a缺失突变体，为更好的研究hoxb7a的功能奠定了基础。

4 结论

本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建斑马鱼hoxb7a基因突变体，发现hoxb7a在hox基因簇中可以调控多个hox基因的表达，尤其对基因组相邻位置的hox基因影响显著。