不同分子量大豆皮多糖的基本结构及功能性质研究

■韩 晴 李军国，2 杨 莹 王 兴 郭丽丽 葛春雨 张嘉琦 李 俊，2*

（1.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；2.农业部饲料生物技术重点实验室，北京100081；3.云南省兽药饲料检测所，云南昆明650201；4.青海省兽药饲料监察所，青海西宁810001）

2017 年我国大豆消费量超过1.1 亿吨，位居世界 首位[1]。大豆制品加工过程会产生大量的大豆加工副产物，如大豆皮[2]等。大豆皮约占整粒大豆总重的8%，主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶类物质组成，是重要的大豆加工副产物[3]。大豆皮由于其高能量和高纤维的特性，常作为反刍动物的粗饲料[3]。然而，大豆皮中存在的抗营养因子会阻碍动物机体对营养物质的消化吸收，影响动物健康及生产性能，因此添加量受限[4]。目前，除作为粗饲料饲喂动物外，绝大多数大豆皮会被当作废料直接弃掉，这种来源广泛的大豆加工副产物并没有得到充分的开发利用。

大豆皮富含纤维素及其他营养物质[5]，其中的纤维素是很好的糖源，通过一定的提取工艺可以制备出具有优良特性的多糖[6-7]。研究表明，多糖具有抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降血脂、降血糖、抗衰老等功效[8-13]。目前，国内对于大豆皮多糖的研究主要集中在多糖的提取、改性和基本理化性质的分析[14-16]，并没有研究对不同分子量大豆皮多糖的结构及功能性质进行对比分析。根据鲍素华等[17]对多糖结构、分子量大小对其生物活性影响的研究可知，多糖分子量大小与其生物活性具有显著的相关性。因此，对不同分子量大豆皮多糖基本结构和功能性质的研究对于大豆皮多糖的针对性开发利用是至关重要的。

本文以大豆皮为原料，通过将热水浸提法得到的大豆皮多糖进行膜分离得到不同分子量的大豆皮多糖。对大豆皮多糖结构进行初步鉴定，并对其功能性质包括抗氧化性、乳化性和起泡性进行分析研究，旨在为充分利用大豆加工副产物，更好地开发和利用大豆皮中的多糖组分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆皮山东蓝山股份有限公司（粗蛋白质15.1%、粗脂肪4.0%、总膳食纤维60.1%、水分6.4%），充分粉碎过40目筛后备用。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），北京Coolaber有限公司提供；标准品葡聚糖Dextran系列（分子量分别为5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），上海Pharmacia 有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PowerWave XS2 酶标仪，美国BioTex 公司；LC-15C高效液相色谱仪（配有岛津RID-10A示差检测器），日本岛津公司；LGJ-12冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；CR22G高速离心机，日本Hitachi 公司；RE-2000 旋转蒸发仪，上海亚荣有限公司；Leica DM2500生物显微镜，德国莱卡公司；TENSOR 37傅里叶变换红外光谱，德国Bruker 公司；5 kU 和1 000 kU超滤膜，天津膜天膜科技股份有限公司；BT00-100W蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆皮多糖的提取

称取大豆皮粉末500 g，加入20 倍体积蒸馏水，搅匀，室温下浸泡搅拌14 h。盐酸调节浸泡液pH 值至4.5，将浸泡好的样品放入高压灭菌锅中，在120 ℃下提取2 h。过滤除去不溶物，将提取液减压浓缩至原体积的20%，加入4 倍体积80%的乙醇溶液进行醇沉，离心收集不溶物，冷冻干燥得到大豆皮多糖SHP。

1.3.2 大豆皮多糖分子量的测定

大豆皮多糖分子量测定采用高效凝胶渗透色谱法。色谱条件：TSK-gel G-5000PWXL 柱（7.8 mm×300 mm；MW 分离极限：7 000 kU; Tosoh），岛津LC-15C高效液相色谱仪；流动相：超纯水，流速：0.6 ml/min，进样量：50 μl，柱温：35 ℃。测定方法：取Dextran 对照品（分子量分别为5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），超纯水溶解，制成1 mg/ml 的对照品溶液，过滤后，在上述色谱条件下进样，记录色谱峰保留时间（tR），以相对分子量的对数值为纵坐标，以tR为横坐标，绘制标准曲线。样品分别以超纯水制成1 mg/ml的溶液，在同样色谱条件下进样，记录样品保留时间，利用标准曲线计算样品分子量。

1.3.3 不同分子量大豆皮多糖的分离

不同分子量大豆皮多糖的分离采用超滤法。根据大豆皮多糖的分子质量，选用截留分子量为5 kU和1 000 kU的两种超滤膜，控制超滤压力为0.1 MPa，蠕动泵转速为60 r/min，超滤速度为2 L/h。收集分离液，经加热蒸发浓缩后，冷冻干燥制得高分子量大豆皮多糖SHP-H和低分子量大豆皮多糖SHP-L。

1.3.4 大豆皮多糖红外光谱的测定

称取大豆皮多糖样品1.5 mg，置于玛瑙研钵中，按照1:50～100 的比例加入干燥的KBr 粉末，充分研磨混合，压片后在4 000～400 cm-1范围内扫描，记录中红外光谱结果。

1.3.5 大豆皮多糖抗氧化性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定[18]

精密称取DPPH 粉末4.5 mg，用无水乙醇配制0.08 mol/l 的DPPH 溶液于棕色容量瓶中，避光保存，备用。将2.0 ml 不同浓度的大豆皮多糖样品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml）与3.0 ml的DPPH溶液混合，室温避光反应30 min。以蒸馏水为空白，于517 nm波长处测定吸光值。以下列公式计算DPPH清除率，实验重复3次。

DPPH清除能力（%）=[A0-（As-Ac）]/A0×100

式中：A0——2.0 ml蒸馏水+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

As——2.0 ml样品溶液+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

Ac——2.0 ml样品溶液+3.0 ml蒸馏水吸光度。

1.3.5.2 还原力的测定[19]

量取2.0 ml 不同浓度的大豆皮多糖样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.5 ml磷酸盐缓冲液（0.2 M，pH值6.6）和2.5 ml 1%的铁氰化钾溶液，充分混合后于50 ℃水浴保温20 min。随后加入2.5 ml 10%的三氯乙酸溶液，混合液3 000 r/min离心10 min。准确吸取上清液2.5 ml，加入2.5 ml 的蒸馏水和0.5 ml 0.1%的三氯化铁溶液，以蒸馏水为空白，在700 nm处测吸光度，实验重复3次。

1.3.5.3 清除羟自由基活性的测定[20]

将1.0 ml浓度为9.0 mmol/l的FeSO4溶液与1.0 ml浓度为10.0 mmol/l水杨酸-乙醇溶液充分混合，再分别加入1.0 ml不同浓度的大豆皮多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.0 ml蒸馏水及1.0 ml 6.0 mmol/l H2O2溶液，37 ℃水浴保温10 min，于510 nm波长处测定吸光度。空白对照组以相同体积蒸馏水替代样品。以下列公式计算羟自由基清除率，实验重复3次。

羟基自由基清除率（%）=[A0-(As-Ac)]/Ao×100；式中：A0——空白对照液吸光度值，只加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、不加入大豆皮多糖溶液的吸光度值；

As——加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、大豆多糖溶液的吸光度值；

Ac——加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、大豆多糖溶液、不加过氧化氢引发反应的吸光度值。

1.3.6 大豆皮多糖乳化性测定

1.3.6.1 乳化液的制备

乳化液由大豆皮多糖、大豆油和磷酸盐缓冲溶液（10 mmol/l、pH值7.0）配制而成。向缓冲液中加入适量多糖，充分溶解后，缓慢倒入大豆油，加入0.4 g/l的叠氮化钠作为防腐剂，用均质机（10 000 r/min）均质乳化3 min。最终乳化液中多糖含量为0.5%（m/V），大豆油含量3.5%（m/V）。

1.3.6.2 乳化活性的测定

乳化液形成后，用磷酸盐缓冲溶液稀释10 倍后在500 nm 波长下测定其吸光度，用相应乳化液的吸光度值表示其乳化活性。

1.3.6.3 乳化稳定性的测定

将乳化液室温放置22 h后，用磷酸盐缓冲溶液稀释10 倍，并在500 nm 波长下测定其吸光度值。以下列公式计算乳化稳定性（ESI），实验重复3次。

ESI=1-(A1-A2)/A1

式中：A1——乳化液形成时的吸光度值；

A2——乳化液室温放置22 h后的吸光度值。

1.3.6.4 乳化液微观结构观察

制备好的乳化液用磷酸盐缓冲液稀释5倍后，取适量制备玻片，使用Leica DM2500 生物显微镜观察液滴分布情况，采集图像。

1.3.7 大豆皮多糖起泡性测定[21]

1.3.7.1 起泡性测定

准确称取2.000 g 多糖样品溶于100 ml 蒸馏水中，调节溶液pH 值为7。测定溶液的初体积，匀浆机搅拌1 min，迅速转移至500 ml量筒中，测定溶液和泡沫的总体积，起泡性用起泡率来表示。

起泡率(%)=（搅打后溶液和泡沫的总体积-溶液的初体积）/溶液的初体积×100

1.3.7.2 泡沫持久性

分别记录搅拌停止10、30、60、90、120 min后泡沫和溶液的总体积，用稳定系数衡量泡沫的持久性。

稳定系数=一定时间段泡沫和溶液的总体积/溶液的初体积

2 结果与分析

2.1 大豆皮多糖分子量测定

利用高效凝胶色谱测定SHP、SHP-L 及SHP-H的相对分子量分布，结果见图1，根据葡聚糖标准品得到回归方程：lgMw=-0.326 3tR+9.512 2(R2=0.982)。根据保留时间计算出SHP 的相对分子量主要分布在8.6×104U和2.5×106U两个部分。SHP-L的相对分子量分布在1.4×105U 左右，SHP-H 的相对分子量分布在2.3×106U 左右。试验结果表明，超滤法可以较好的将SHP不同的分子量组分进行分离。

2.2 大豆皮多糖红外光谱测定

SHP、SHP-L 及SHP-H 在3 500～800 cm-1范围内的FTIR图谱如图2所示。1 000～3 500 cm-1区域的FTIR光谱包括三种多糖组分中的主要化学官能团，这段区域通常用于鉴定多糖[22]。3 400～3 500 cm-1之间的吸收峰来自羟基。2 800～3 000 cm-1和1 400～1 450 cm-1之间的吸收峰是由烷基引起的。1 000～1 200 cm-1之间的区域表明存在羧基。同时，FTIR图谱表明SHP与SHP-H 在特征官能团方面无显著差异。SHP-L 与SHP 及SHP-H 相比出现了部分吸收峰的缺失。SHP及SHP-H在1 726 cm-1和1 743 cm-1处出现吸收峰带，表明SHP和SHP-H存在糖醛酸[22]。而SHP-L和SHPH在868 cm-1均失去了吸收峰，表明经过超滤分离后，两种不同分子量组分失去了原始多糖的β构型[23]。

2.3 大豆皮多糖抗氧化性分析

图1 （A）SHP、（B）SHP-L和（C）SHP-H 在TSK-凝胶G-5000 PWXL柱上的凝胶过滤色谱

SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性分析结果见图3。图3A 为SHP、SHP-L 及SHP-H 的DPPH 清 除 率 结果。清除稳定的DPPH 自由基被广泛用于评估天然化合物的抗氧化性[24]。由图3A 可知，在指定浓度范围内，三者DPPH 自由基清除能力大小顺序为SHP＞SHP-L＞SHP-H，无论是高分子量大豆皮多糖还是低分子量大豆皮多糖均对DPPH自由基具有清除活性，尤其是低分子量大豆皮多糖SHP-L，该结果与前人研究结果吻合，即小分子量多糖的DPPH清除能力较强[25]。研究表明，DPPH 清除能力取决于良好的疏水性和在反应介质中良好的扩散性[26]。本试验中，SHPL在溶解度方面要明显好于SHP-H，可以很快溶解在反应介质中，这将有效提高SHP-L的DPPH自由基清除能力。此外，SHP的DPPH清除能力最强，可能与未分离的多酚和小分子色素有关。

SHP、SHP-L及SHP-H羟基自由基清除能力效果见图3B。羟基自由基的化学性质活泼，可损伤蛋白质、核酸之类等生物大分子[27]。由图可知，SHP、SHPL 及SHP-H 三者中羟基自由基清除能力最强的为SHP-L，SHP及SHP-H的清除能力无较大差异。与前人结果相同，大豆皮多糖的羟基自由基清除能力会随着多糖分子量的降低而增强[28]。这可能是因为SHPH 的渗透能力相对较差，而SHP-L 水溶性强，渗透能力强，生物活性高。

图2 SHP、SHP-H及SHP-L的FTIR图谱

图3C 为SHP、SHP-L 及SHP-H 还原力结果。物质的还原能力与其抗氧化性有着明显的相关性，还原力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱[29]。三者中，SHP-L 的还原力最强，在较低浓度时，SHP-H 的还原力要大于SHP，但随着浓度的增大，SHP 的还原力逐渐增强超过SHP-H。

图3 SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性结果

综合DPPH清除率、羟基自由基清除率和还原力的结果可知，在一定质量浓度范围内，大豆皮多糖的抗氧化能力与质量浓度呈正相关增长趋势。此外，多糖的抗氧化能力与相对分子量有关，分子量越低抗氧化能力越强。

2.4 大豆皮多糖乳化性测定

图4 SHP、SHP-L及SHP-H乳化活性及乳化稳定性

SHP、SHP-L 及SHP-H 乳化性见图4。在乳化活性方面，SHP-H 的乳化活性最强，SHP 次之，SHP-L的乳化活性较低。图5 的乳化液滴分布情况也同样显示了SHP、SHP-L 及SHP-H 的乳化能力，由SHPH 制备的乳化液油滴分布较多也较均匀，SHP-L 制备的乳化液油滴分布不均匀，油滴形态大小不一。在乳化稳定性方面，SHP 的乳化稳定性最好，SHP-H次之，最差是SHP-L，但三者之间无较大差异。根据Li[30]，壳聚糖的乳化活性随着相对分子量的增加而增加。因此，高分子量级的大豆皮多糖与低分子量相比具有更强的乳化性。多糖的乳化活性取决于多糖的组成和乳化液体的类型[31]。因此，需要进一步研究来解释不同因素对大豆皮多糖乳化性的综合影响。

图5 SHP、SHP-L及SHP-H乳化液液滴分布

2.5 大豆皮多糖起泡性测定

一种具有较好起泡性能的物质是很好的表面活性剂。多糖具有良好的溶解性、亲水性、亲油性和极性基团，因此具有一定的起泡能力和泡沫稳定能力。SHP、SHP-L及SHP-H的起泡性见图6及图7。由图6可知，SHP 和SHP-H 的发泡率无差异，但要明显好于SHPL。图7显示了SHP、SHP-L及SHP-H的泡沫稳定性，由图可知，SHP-H 具有较好的泡沫稳定能力，其次是SHP，而SHP-L的泡沫稳定能力最差。研究表明，随着溶液黏度的增大，液膜的表面强度也增加，液膜排液速度降低，液膜强度更大，泡沫的稳定性也越好[32]。计晓曼等[33]对普兰多糖的黏度性质的研究表明，相对分子量的增大会使多糖溶液的黏度增加，因此，本试验中，SHP-H溶液较高黏度可能有助于提高其泡沫稳定性。

图6 SHP、SHP-L及SHP-H发泡率

图7 SHP、SHP-L及SHP-H泡沫稳定性

3 结论

利用热水浸提法和超滤法对大豆皮多糖进行了提取和分离，得到大豆皮多糖SHP及不同分子量大豆皮多糖组分SHP-L 及SHP-H，并对三种不同分子量分布的多糖进行了基本结构及功能性质的分析。HPLC 的结果表明，SHP 的相对分子量主要分布在8.6×104U及2.5×106U附近，SHP-L及SHP-H的相对分子量分别分布在1.4×105U 和2.3×106U 左右。FTIR 图谱结果表明，SHP-H 与SHP 无特征官能团上的差异，而SHP-L与多糖原液相比出现了部分吸收峰的缺失。抗氧化结果表明，三种多糖组分均具有抗氧化能力，小分子量的SHP-L抗氧化性最强。而乳化性和起泡性的结果表明，大分子量的SHP-H 具有比SHPL 及SHP 更好的乳化性和起泡性。本研究可为大豆皮多糖进一步研究及开发利用提供一定的理论依据。

4 展望

大豆皮作为大豆加工过程中产生的副产物，在相当长的一段时间里并没有得到充分利用。利用大豆皮提取大豆皮多糖可以有效的实现大豆加工副产物的开发再利用。研究适合我国国情的大豆皮多糖制品，不仅可以解决大豆皮引起的环境问题和商业难题，还可以带动相关产业发展。如果能对大豆皮多糖的利用和开发进行深入研究，将进一步提升豆皮和大豆皮多糖的利用价值。