酶解协同超声波法提取香椿子总黄酮工艺优化

■刘玉梅 张家俊 吴 浪 胡美忠 郁建生

（铜仁职业技术学院中兽药国家民委重点开放实验室，贵州铜仁554300）

目前，工业化动物养殖为人们提供了大量廉价动物蛋白，与此同时也造成了严重的环境污染问题，抗生素通过食物链进入人体造成人体抗生素残留问题以及耐药菌产生等问题。因此，寻找一系列安全、高效且价格低廉的能够在工业化动物养殖中替代抗生素的药物就显得越来越重要。黄酮类化合物是一类广泛存在于种子、根、茎、叶等植物组织中的生物活性小分子化合物，有很强的药理作用且毒副作用小。近年来，有研究者发现天然黄酮类化合物能显著提高动物对糖、蛋白质和脂肪的代谢，促进营养成分的转化，增强机体蛋白质的合成能力，进而使动物的生产性能提高[1-5]；因黄酮类化合物结构与雌二醇相似，其还具有一定的雌激素样活性，能提高奶牛生长激素、催乳素及雌二醇水平[6]；此外黄酮类化合物还具有抗氧化[7]、免疫调节等[8]作用。

天然黄酮类化合物的产量、药效与提取工艺都有很大的关系。现阶段，用于天然黄酮类化合物的提取方法主要有有机溶剂提取法、微波辅助提取法、二氧化碳超临界提取法、超声波辅助提取法、酶解法等。其中超声波提取法在实验室被广为使用，其优点在于设备要求低、提取时间短、操作简便；酶解法也因可提高有效成分的提取率而受到越来越多的关注。香椿子是香椿的干燥成熟果实，一些研究者发现其含有丰富的黄酮类化合物[9-11]，且香椿黄酮具有抗氧化[12]、抑菌[13]、降糖[14-15]、降尿酸[16]等药理作用。但将酶解结合超声波对香椿子总黄酮进行提取的方法还未见报道。本文将超声波技术与酶解技术相结合，应用单因素、正交试验方法，为香椿子总黄酮的提取提供了一种高效的提取方法，以期为后续香椿子总黄酮在绿色饲料添加剂中的开发应用提供技术支撑，进而为安全、健康、可持续发展的工业化动物养殖做一定的贡献。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香椿子

香椿子采自铜仁市万山区谢桥街道石竹村，60 ℃烘箱干燥2 h，粉碎后过60目筛，阴凉干燥处密闭保存待用。

1.1.2 主要试剂

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，含有量大于98%)。无水乙醇、甲醇、石油醚、三氯化铝、醋酸钠、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠为市售分析纯；果胶酶(5×104U/g)购自南宁庞博生物工程有限公司；水为超纯水。

1.1.3 主要仪器

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；New human power Ⅰ纯水仪(韩国Human公司)；CPA225D 型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；CP153型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；SB5200D型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；雷磁PHS-25型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；TDZ4-WS型台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；DHG-9030A型鼓风干燥箱( 上海慧泰仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品10 mg，置于50 ml 容量瓶中，以50%甲醇溶解，定容，充分振荡混匀得0.2 mg/ml芦丁标准溶液。用移液管分别精密移取0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml芦丁标准溶液于50 ml容量瓶中，分别加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，摇匀，静置15 min，用pH值为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，摇匀后超声震荡5 min，得6个浓度的芦丁测定液。

取其中一个浓度的芦丁测定液在TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计上进行光谱扫描，确定最大吸收波长。于最大吸收波长处依次测定6个浓度的芦丁测定液的吸光度，用浓度校正法绘制芦丁标准曲线。

1.2.2 香椿子总黄酮提取及含量测定

100 g粉碎过筛后的香椿子粉末置于1 000 ml平底烧瓶中，加入500 ml石油醚回流提取1 h，提取两次，合并滤液后减压浓缩得香椿子油脂。滤渣于通风橱中挥干石油醚后60 ℃烘干，阴凉干燥处密闭保存备用。

精密称取石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，置于20 ml具塞玻璃管中，加入提取液（N ml），在设定条件下进行酶解提取。提取结束后用相应的乙醇溶液补足失重后将滤液转移至10 ml离心管中4 000 r/min离心10 min，上清液用移液器转移到离心管中备用。移取1 ml 滤液，加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，摇匀，静置15 min，用pH 值为5.8 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至10 ml，摇匀后超声震荡5 min，在416 nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算该溶液中总黄酮浓度C(mg/ml)。最终计算香椿子总黄酮含有量，公式为：总黄酮含量=(C×N×10)/0.2（mg/g）。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 酶解pH值

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果胶酶浓度为每100 ml乙醇溶液0.5 g果胶酶）的75% 乙醇溶液10 ml，用HCl和NaOH将pH值分别调至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，在50 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.2 酶解温度

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果胶酶浓度为每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果胶酶）的75%乙醇溶液10 ml，pH值调至3.5，分别在35、40、45、50 、55 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.3 酶解时间

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果胶酶浓度为每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果胶酶）的75%乙醇溶液10 ml，pH值调至3.5，在50 ℃下分别超声提取10、20、30、40、50 min。按1.2.2 节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.4 乙醇浓度

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后分别加入含果胶酶（果胶酶浓度为每100 ml乙醇溶液0.5 g果胶酶）的乙醇溶液10 ml（乙醇浓度分别为55%、65%、75%、85%、95%），pH值调至3.5，在50 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.5 液料比

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml 具塞玻璃管中，编号后分别加入含果胶酶（果胶酶浓度为每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果胶酶，记为0.50%）的75%乙醇溶液10 ml（液料比50:1）、8 ml（液料比40:1）、6 ml（液料比30:1）、4 ml（液料比20:1）、2 ml（液料比10:1），pH 值调至3.5，在50 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.6 酶用量

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分别置20 ml 具塞玻璃管中，编号后分别加入含果胶酶（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%）的75%乙醇溶液10 ml。pH 值调至3.5，在50 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选用酶用量(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)、酶解时间（D）进行正交试验，正交因素水平见表1。称取脱脂后的样品0.2 g，共9份，以总黄酮含量为评价指标，优化提取工艺。

表1 正交试验因素水平

1.2.5 验证试验

精密称取石油醚脱脂后香椿子粉末6 份，每份0.2 g，其中3份按优选的工艺进行酶解提取；另3份不加酶直接提取，分别测定总黄酮提取率。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

黄酮类化合物经AlCl3显色后，与铝离子形成稳定的络合物，苯甲酰基部分引起的吸收带(300～400 nm)红移，吸光度明显增大且专属性提高[17]。芦丁经AlCl3显色后，其365 nm 处吸收峰红移至416 nm，且吸光度有所增加，见图1。

图1 芦丁显色前、后紫外可见光谱

在最大吸收波长416 nm 处，按照1.2.1 节方法绘制芦丁标准曲线，为C=31.7A-1.05，R=0.999 9，在2.0～20.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2 酶解提取方法

2.2.1 单因素试验结果

酶只有在特定的pH 值、温度下才能达到最大的活性，果胶酶的作用pH 值为2.5～6.0，作用温度为15～55 ℃。在香椿子总黄酮的酶解提取试验中，最佳酶解pH 值为3.5，最佳作用温度为50 ℃，见图2A、2B。后续试验中，为达到最佳的提取效果，我们将pH值调至3.5，温度控制在50 ℃。

酶解时间对总黄酮提取率的影响见图2C，从图2C可以看出，当酶解时间延长至20 min 以后，香椿子中总黄酮提取率没有明显变化，说明20 min 时酶解反应已基本完成。故选10、20、30 min进行正交试验。

提取液中乙醇浓度对香椿子总黄酮提取率的影响见图2D，从图2D 可以明显看出，乙醇浓度对香椿子总黄酮提取率的影响非常大，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率逐渐增加，当乙醇浓度达到75%以后，提取率的增加速度明显变缓。故选取65%、75%、85%乙醇进行正交试验。

液料比对提取率的影响见图2E，从图2E 可以看出，随着液料比的增加，提取率逐渐增加，当液料比达到40:1以后，提取率的增加已经不明显了。因此选液料比30:1，40:1，50:1进行正交试验。

图2 单因素试验结果

酶用量对总黄酮提取率的影响见图2F，酶的加入，使植物中的细胞壁被破坏，其中果胶等高分子化合物被分解为小分子物质，有效减小黄酮等小分子化合物的溶出阻力，以达到提高总黄酮的提取率的效果。因此酶的用量对总黄酮的提取率的影响非常关键。从图2F可以看出，随着酶用量的增大，香椿子总黄酮提取率逐渐升高，当用量达到1.00% 时，香椿子总黄酮提取率出现峰值，随后随着酶用量的增大总黄酮提取率略有下降，可能原因是当酶过量时，香椿子粉末将会被大量的酶包裹，导致提取不彻底。所以我们选用酶用量为0.75%、1.00%、1.25%进行正交试验。

2.2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，采用正交试验设计对最佳酶解工艺进行优化，结果见表2。各因素对香椿子总黄酮提取率的影响顺序为B＞D＞A＞C，即乙醇浓度＞酶解时间＞酶用量＞液料比。乙醇浓度对提取率的影响最大，其次是酶解时间，酶浓度及液料比，最佳酶解提取工艺为A3B3C2D3，即酶用量1.25%，乙醇浓度85%，液料比40:1，酶解时间30 min。

表2 正交试验结果

2.2.3 验证试验结果

按照最佳工艺条件A3B3C2D3进行重复性试验3次，香椿子总黄酮的平均提取率为26.41 mg/g，RSD为0.27%，说明该提取工艺稳定。为比较酶解辅助提取的优势，按照不加酶的最佳提取条进行重复性试验3次，香椿子总黄酮的平均提取率为22.39 mg/g，RSD为0.61%。酶解法与未经酶解法相比，总黄酮的提取率提升了17.95%。

3 讨论与结果

近年来，酶解法在提高植物有效成分的提取率方面的研究、应用越来越多[18-21]。其主要原因是酶能使植物体内大分子化合物如果胶、纤维素、淀粉、蛋白质等分解为小分子，从而减小其对植物体内生物小分子化合物的束缚力，进而提高植物有效成分的提取率。不同的植物、植物部位以及不同的目标化合物所需要的酶是不同的，本实验考察了果胶酶、纤维素酶及果胶酶与纤维素酶的复合酶对香椿子总黄酮提取率的影响，发现果胶酶能使香椿子总黄酮的提取率达到最大，所以我们选择果胶酶对香椿子进行酶解。

本试验探讨了果胶酶酶解协同超声提取香椿子中总黄酮的工艺条件，采用单因素试验和正交试验考察了酶解时间、乙醇浓度、液料比、酶用量等因素对提取率的影响，同时通过验证试验对最佳工艺进行分析。研究结果表明在果胶酶的最佳作用pH 值（3.5）和最佳作用温度（50 ℃）下，香椿子总黄酮果胶酶协同超声波法的最佳提取条件为：酶用量1.25%，乙醇浓度85%，液料比40:1，酶解时间30 min，在此条件下，香椿子总黄酮提取率为26.41 mg/g，与同等条件下不加酶提取相比，总黄酮的提取率提升了17.95%。说明该提取方法具有显著的优势，为进一步开展香椿子总黄酮的应用研究奠定了基础。