microRNA-21、Caspase-3、Caspase-9在舌鳞状细胞癌中的表达水平

陈筱雪 孙斌 黎昌学

口腔舌癌是口腔颌面部常见恶性肿瘤，其进展中发生多种信号通路的异常激活，且98%以上的舌癌为鳞状细胞癌［1］。通过舌鳞癌组织中蛋白质组学分析，搜索肿瘤相关蛋白，可了解癌症的分子发病机制外，还可能作为生物标志物具有潜在的临床应用，能够在高风险个体的早期阶段识别肿瘤，预测治疗反应，残留或复发癌治疗后尽早发现。促癌基因microRNA-21作为多种肿瘤中典型的代表，位于染色体17 p 23.2的脆性位点，其过量表达会诱导肿瘤的进展，并特异性地作用靶向基因，在细胞凋亡中起着不可替代的作用［2］。宋刚等［3］、蒋丽等［4］及刘涛等［5］研究认为microRNA-21参与大肠癌、结肠癌与食管癌等多种肿瘤的进展，并有可能通过影响相关线粒体凋亡通路的表达而发挥作用。本实验拟通过检测舌癌旁组织及舌鳞状细胞癌组织中microRNA-21以及线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9的表达情况，初步明确其在舌鳞状细胞癌中表达的相关意义，为临床舌癌提供相关参考资料。

1 资料与方法

1.1 标本采集

选取2016-01～2018-08在新疆石河子大学第一附属医院及新疆维吾尔自治区人民医院舌鳞状细胞癌患者33例。纳入标准：①经病理科诊断明确者［6］；②临床肿瘤分期明确，均未经任何放化疗治疗者；③所有组织标本去除出血、坏死及电灼组织者；④临床资料完整者，所以患者均收集其舌癌组织和癌旁正常组织，各33例；⑥入选患者均获得知情同意。其中男性21例，女性12例；年龄36～77岁，平均（61.22±4.38）岁；高分化舌鳞癌15例、中分化舌鳞癌10例，低分化舌鳞癌8例；有颈淋巴结转移13例，无颈淋巴结转移20例。

1.2 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测方法

利用昆泰锐（新疆）生物公司合成引物，将U6为内参照物，采用SYBR Green法定量检测以下mRNA表达水平。收集新鲜组织置于离心管中，总RNA提取及RT-qPCR反应体系均严格按试剂盒说明书进行，数据由软件自动提供。PrimerPmmier 5软件设计合成引物如下：U6引物序列，上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，NM-138085.1，全长为102 nt，扩增产物为27 bp；Caspase-3引物序列，上游5'-AGACCATACATGGGAGCAAG-3'，下 游 5'-GTCCACATCCGTACCAGAGC-3'， NM-009810.3，全长为176 nt，扩增产物为23 bp；Caspase-9引物序列，上游5'-GTGAACTTCTGCCCTTCCTCG-3'，下 游 5'-CCATCAAAGCGTGACCATTT-3'， BC-056447.1，全长为182 nt，扩增产物为23 bp；microRNA-21引物序列，上 游 5'-CTTCAGGGGCAATGAGACGAC-3'，下 游 5'-GCACATTGGGGATGAACAGC-3'，NM-001329396.1，全长为105 nt，扩增产物为21 bp。取逆转录产物于Real-time PCR仪上进行扩增并检测荧光。20μl实时定量PCR反应体系如下：SYBR Green Master（ROX）10μl，上游引物（5μmol/L）0.4μl，下游引物（15μmol/L）0.5μl，cDNA 2μl，用DEPC处理水补齐20μl。PCR反应条件：94℃预变性10 min，活化Tag DNA polymerase酶0.2μl、H2O 7.4μl；具体反应条件为：变性95℃180 s，退火、延伸95℃12 s，62℃50 s，共循环40次所有反应均设复孔3个，以减少加样等造成的误差影响实验结果，记录每个反应管中的荧光信号到达设定的阂值时所历经的循环数即CT值，按照2-ΔΔCT法统计定量分析以上miRNA21与内参平均吸光度值，以两者吸光度比值作为目的基因相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0进行数据统计学分析，计量资料±s表示，以内参基因U6作为参照，舌鳞状细胞癌与癌旁正常组织的相对表达结果，以及与舌鳞癌各临床病理参数的关系采用配对t检验，并采用Pearson相关系数分析microRNA21与Caspase-3、Caspase-9间是否存在相关性。P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 qRT-PCR 检测microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鳞状细胞癌组织中的表达

舌鳞状细胞癌中microRNA-21 mRNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织（P＜0.05），而Caspase-3、Caspase-9的相对表达量明显低于癌旁正常组织（P＜0.05）（表1）。

表1 qRT-PCR检测microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鳞状细胞癌组织中的表达情况分析Tab 1 Analysis of microRNA-21 RNA，Caspase-3 RNA and Caspase-9 RNA expression in tongue squamous cell carcinoma by qRT-PCR

2.2 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达与舌鳞癌各临床病理参数的关系

microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达均与患者的性别（男/女）、年龄（≤60岁）比较无明显统计学意义（P＞0.05）；但与组织分化、颈淋巴结转移有明显统计学意义（P＜0.05），其中低分化与有颈淋巴结转移组织的microRNA-21 RNA表达明显高于高分化与无颈淋巴结转移组织（P＜0.05），而低分化与有颈淋巴结转移组织的Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达明显低于高分化与无颈淋巴结转移组织（P＜0.05）（表2）。

2.3 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鳞状细胞癌组织中表达的相关性分析

在舌鳞状细胞癌组织中，microRNA-21 与Caspase-3表达呈显著负相关（r=-0.598，P＜0.001），microRNA-21与Caspase-9表达呈显著负相关（r=-0.652，P＜0.001）。

表2 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达阳性率与舌鳞癌各临床病理参数的关系 ［n（%）］Tab 2 Relationship between microRNA-21 RNA，Caspase-3 RNA，Caspase-9 RNA expression and clinical pathological parameters of tongue squamous cell carcinoma ［n（%）］

表3 microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA在舌鳞状细胞癌组织中表达的相关性分析Tab 3 Correlation analysis of microRNA-21 RNA with Caspase-3 RNA or Caspase-9 RNA expression in tongue squamous cell carcinoma

3 讨 论

头颈部/口腔鳞状细胞癌是多种多样的癌症，在各种器官中发生的复杂疾病，包括口腔，舌，咽和喉，其从许多不同的解剖部位发展并且与不同的风险因子和遗传特征相关，来自这些不同部位的肿瘤具有不同的临床表现和临床结果，并且与不同的风险因素和遗传特征相关［7］。舌鳞状细胞癌是最常见的口腔部位之一，其发病率实际上在年轻和中年人群中增加。就局部入侵和传播而言，舌鳞状细胞癌比其他形式的头颈部/口腔鳞状细胞癌明显更具攻击性，具有快速局部侵袭和扩散的倾向［8-9］。癌细胞具有遗传改变，其被转化为独特的表达模式，这些模式可以将癌细胞与相同来源的正常组织分离，并用作分子生物标志物［10］。此外，表达模式变化可能比临床疾病检测早得多。这些模式的鉴定对于早期检测和诊断以及鉴定新的治疗靶标具有显着的指导价值。

microRNA-21的靶基因PTEN可以抑制P13K/Akt信号转导途径的功能，而活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase-9表达等，调控细胞的增殖、分化、凋亡［11-12］。早年研究显示，敲低microRNA-21后可以抑制Tb3.1人舌癌细胞增殖与侵袭能力，提示microRNA-21可能是促进舌鳞状细胞癌发生的因子［13］。microRNA-21可使Bcl-2表达上升，Bcl-2可介导线粒体外膜来释放细胞色素C，激活Caspase-3，启动Caspase级联反应［14］。本实验拟检测舌癌旁组织及舌鳞状细胞癌组织中microRNA-21以及线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9的表达情况，及其表达率与舌鳞癌各临床病理参数的关系。近年来研究发现，致癌基因miRNA21过量表达会促进肿瘤的进展，并特异性地作用于癌基因、抑癌基因，如癌基因Bcl-2、Serpinil、RhoB等，肿瘤抑制基因PTEN、RECK和hMSH2等，最终调节转录后水平基因的表达，影响细胞的增殖凋亡等［15-16］。细胞增殖和分化及凋亡异常会导致肿瘤的发生，激活或启动自身内一系列特殊蛋白基因程序，如Caspase家族蛋白参与了细胞凋亡过程。Caspase中包含的凋亡启动因子中的Caspase-9在发生自我活化后，可激活下游的Caspase；而凋亡执行因子中的Caspase-3可导致细胞凋亡，是主要的效应因子［17］。细胞凋亡其中一条途径是线粒体凋亡通路，通过活化凋亡效应蛋白Caspase 3、6、7、9及PPAR，最终使DNA断裂细胞凋亡，故这些效应蛋白Caspases在细胞凋亡的过程中发挥关键作用［18］。

庞文彪等［19］研究在中国地鼠口腔黏膜癌变过程中，发现鳞癌组织中Caspase-3、Caspase-9表达明显降低，但随着增生程度的加重，Caspase-3、Caspase-9表达明显降低，揭示了Caspase-3、Caspase-9表达与口腔鳞癌的发生、发展密切相关。顾小军等［20］研究结果表明口腔鳞癌患者唾液上清液中microRNA-21的表达上调，可能与口腔鳞癌的发生发展有关。故本研究推测MicroRNA-21在舌鳞状细胞癌的发病中起重要作用，其可能通过影响线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9的表达，从而抑制了凋亡的发生，导致了舌鳞状细胞癌的发生、发展。本研究结果发现，舌鳞状细胞癌中microRNA-21 mRNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织，而Caspase-3、Caspase-9的相对表达量明显低于癌旁正常组织，结果与Giovannetti等［16］、顾小军等［20］的报道一致。而Caspase-3、Caspase-9的表达下降，且与miRNA21表达水平呈负相关，该结果提示舌鳞状细胞癌组织的发生发展过程中高表达的miRNA21通过抑制细胞凋亡而促进细胞的转化和增殖，而其抑制凋亡可能是通过直接或间接抑制Caspase-3、Caspase-9活性达到的［7，16，20］，这表明miRNA21的高表达和Caspase-3、Caspase-9的低表达可能共同参与了舌癌 的发病过程，并 且 miRNA21 对 Caspase-3、Caspase-9凋亡通道可能存在负反馈机制。而本研究进一步结果证实舌鳞状细胞癌中microRNA-21与Caspase-3、Caspase-9表达呈显著负相关。最后，本研究还表明microRNA-21 RNA、Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达均与患者的性别、年龄（≤60岁）比较无差异；但与组织分化、颈淋巴结转移有差异，其中低分化与有颈淋巴结转移组织的microRNA-21 RNA表达明显高于高分化与无颈淋巴结转移组织，而低分化与有颈淋巴结转移组织的Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表达明显低于高分化与无颈淋巴结转移组织。目前，已有针对miRNA21的靶向治疗［21］（目前针对micRNA21常见的抑制剂包括anti-microRNA寡核苷酸（anti-microRNA oligonucleotide，AMOs）、锁 核 酸（Locked nucleic acid，LNA）、microRNA小分子抑制剂等）与其他促凋亡治疗结合，协同治疗肿瘤的多项研究；增加Caspase-3、Caspase-9表达，和/或抑制miRNA21在肿瘤组织中的表达，可能将在抗肿瘤治疗中具有重要价值。

综上所述，microRNA-21、Caspase-3、Caspase-9可能参与舌鳞状细胞癌的形成，miRNA-21可能通过调节Caspase-3，Caspase-9线粒体凋亡通道来影响舌鳞状细胞癌的发生发展。而对3种基因之间相互作用机制的进一步研究，可能会给舌鳞状细胞癌的诊治带来新的理论依据。本研究有待后期进行细胞学和实验动物相关研究，进一步验证靶向基因治疗的可行性。