Calpain2在FN诱导的口腔鳞癌细胞上皮间质转化中的作用

张玉莲 龚靖淋 刘一秀 李真华 周晓红 叶果

口腔鳞状细胞癌（OSCC）为常见的恶性肿瘤之一，尽管患者术后经化疗控制病情发展，但5年生存率仍不足50%［1-2］。因此，寻求新的治疗手段成为临床治疗OSCC的新希望。上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是近年来肿瘤发生发展的研究热点，EMT的发生被认为是癌症转移的启动过程，其可使上皮细胞来源的恶性肿瘤获得侵袭能力［3］。研究发现，钙激活中性蛋白酶2（calcium-activated neutral protease2，calpain2）过表达可通过肾细胞癌中的AKT/mTOR信号传导促进细胞转移和增殖［4］。另有研究发现，在乳腺癌中纤连蛋白（fibronectin，FN）诱导MCF-7细胞EMT的同时伴随Calpain1和Cal-pain2蛋白表达的上调［5］。这些说明Calpain2可能参与包括EMT在内的肿瘤细胞的多种恶性生物学行为。因此本实验以口腔鳞癌Tca8113细胞为研究模型，FN诱导模型细胞EMT，观察Calpain2在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人口腔鳞癌Tca8113细胞（中国科学院上海细胞库）。

1.1.2 试剂 RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）（Gibco公司，美国）；FN（Sigma公司，美国）；总蛋白提取试剂盒和细胞裂解液（上海碧云天公司）；Calpain2 siRNA转染试剂盒（上海吉玛公司）；抗E-cadherin抗体（货号3195）和抗Twist抗体（46702）（CST公司，美国）；抗Calpain2抗体（sc-373966）（Santa Cruz公司，美国）；抗GAPDH 抗体（AP0063，内参）、羊抗小鼠IgG-HRP及羊抗兔IgGHRP（BS13278和BS12478）（南京巴傲得公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（Millipore公司，美国）。

1.1.3 仪器 20、200和1 000μl移液器（Gilson公司，法国）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司，日本）；Allegra 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机（Beckman Coulter公司，美国）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）；DYY-7C电泳仪（GE公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人口腔鳞癌Tca8113细胞以含12% FBS及1%青链霉素的RPMI 1640高糖培养基培养；细胞放置于37℃、5%CO2的培养箱中，生长至70%汇合度进行传代。

1.2.2 侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力 实验前拿出Matrigel胶放于冰上融化。用RPMI 1640培养基稀释Matrigel胶至浓度为250μg/ml。吸取稀释好的培养基基质胶混合物100μl于小室中，避免打入气泡。将培养板放置到培养箱静置3 h。将同步化24 h的Tca8113细胞或siRNA处理过的Tca8113细胞消化制成细胞悬液并调整细胞密度至1×106个/ml，吸取混合均匀的细胞悬液200μl轻轻加入Transwell小室。在小室外的24孔板下室中加入800μl含趋化因子及高浓度FBS的RPMI 1640培养基，放置于培养箱培养24 h。24 h后倒掉侵袭小室中的培养基并用PBS洗2遍，甲醇固定20 min，PBS洗2遍，放入到0.5%结晶紫水溶液中染色20 min，PBS洗2遍，用棉签轻轻擦掉小室内房细胞，放置5～10 min风干。倒置显微镜下观察并取6个视野拍照并计数，计算侵袭率。

1.2.3 蛋白印迹检测蛋白表达 用总蛋白提取试剂RIPA细胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1 mmol/L）裂解细胞，12 000 r/min离心20 min，吸取上清，采用BCA试剂盒蛋白定量，计算并制备样品。进行蛋白印记检测，每泳道上样量为30 μg，SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将分离蛋白电转移至PVDF膜上；配制5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min；然后按要求加入Calpain2抗体（1∶1 000）、Twist抗体（1∶1 000）或E-cadherin抗体（1∶1 000）等4℃孵育过夜。一抗处理后，TBST洗膜3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记二抗（1∶2 000），室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色，Syngene Imaging System进行成像，以Image J对蛋白印迹条带进行处理和分析。

1.2.4 siRNA转染沉默Calpain2表达 转染前24 h用1 ml高糖1640全培养基将模型细胞接种在6孔板上，每孔4×105个细胞，待细胞汇合度达到70% ～90%时，更换培养基。siRNA的转染浓度为60 pmol/ml，提前准备配制siRNA-lipo2000混合液，预先将lipo2000试剂轻轻摇匀，按需取出适量，用高糖1640培养基稀释并轻轻混合，常温放置5 min；高糖1640培养基稀释siRNA，轻轻混合；将稀释好的lipo2000与稀释好的siRNA混合并轻轻混匀，常温放置20 min以形成siRNA-lipo2000混合物。设立Calpain2转染组（siRNA-Calpain2）和空载对照组（siRNA-NC），将相应siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液的6孔板中，十字摇晃混合。将培养板置于37℃的CO2培养箱中24 h后进行其他实验。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计学分析处理，数据以±s表示，统计量n=6。整体数据分布不符合正态分布，组内两样本比较用Mann-whitney检验。检验水准α=0.05，P＜0.05差异有统计学意义（双尾）。

2 结 果

2.1 FN对Tca8113细胞Calpain2及EMT标志物的影响

Western blot检测Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表达水平；FN（15μg/ml）处理Tca8113细胞12、24、48 h发现，各时间点Calpain2、Twist和E-cadherin相对蛋白表达量，与0 h相比，Calpain和Twist蛋白表达逐渐增加，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；E-cadherin蛋白表达逐渐降低（P＜0.05或P＜0.01）（图1）。

2.2 FN对Tca8113细胞侵袭能力的影响

侵袭小室实验观察FN对Tca8113细胞侵袭能力的影响，与空白对照组（Control）相比，FN（15μg/ml）组细胞侵袭数增加了（116.7±5.1）%（图2）。

图1 FN对Tca8113细胞Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表达的影响Fig 1 The effect of FN on the expression of Calpain2，Twist and E-cadherin proteins in Tca8113 cells

图2 FN对Tca8113细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色，×100）Fig 2 The effect of FN on the invasion ability of Tca8113 cells（Crystal violet staining，×100）

2.3 Calpain2沉默对FN诱导的Tca8113细胞EMT标志物的影响

siRNA转染沉默Calpain2蛋白表达，FN处理各组细胞48 h。与siRNA-NC组相比，siRNA-Calpain2组蛋白表达下调（90.3±3.3）%（P＜0.01）。与siRNANC组相比，siRNA-Calpain2组由FN诱导的E-cadherin蛋白表达下调及Twist蛋白表达上调被逆转（P＜0.01）（图3）。

2.4 Calpain2沉默对FN诱导的Tca8113细胞侵袭能力的影响

siRNA转染沉默Calpain2蛋白表达，FN处理各组细胞48 h。与siRNA-NC组相比，siRNA-Calpain2组细胞侵袭数下降（51.3±4.5）%（P＜0.01）（图4）。

图3 Calpain2沉默对FN诱导的Tca8113细胞Twist和E-cadherin蛋白表达的影响Fig3 The effect of calpain2 silencing on FN-induced Twist and E-cadherin protein expression in Tca8113 cells

图4 Calpain2沉默后FN对Tca8113细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色，×100）Fig 4 The effect of FN on the invasive ability of Tca8113 cells after Calpain2 silencing（Crystal violet staining，×100）

3 讨 论

EMT在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤的发生发展中扮演了重要角色［6］。研究报道，口腔鳞癌细胞发生EMT伴随细胞迁移和侵袭能力的增强［7］。而EMT的发生机制为细胞E-Cadherin蛋白的减少或丢失以及N-钙黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）或FN等间质表型蛋白表达上调［8］。另外Twist蛋白表达上调也为EMT的标志之一，其为一个高度保守的转录因子，可与E-cadherin结合并抑制后者的活性。

本研究以FN刺激Tca8113细胞后发现模型细胞E-cadherin蛋白表达下调，Twist蛋白表达上调，同时细胞侵袭能力增强。提示FN诱导Tca8113细胞发生EMT。进一步实验发现FN还可诱导Calpain2蛋白表达的上调。为观察Calpain2在FN诱导Tca8113细胞EMT中的作用，本研究采用siRNA转染沉默Calpain2蛋白表达，再以FN刺激模型细胞。结果发现沉默Calpain2后，模型细胞Tca8113由FN诱导的E-cadherin表达下调和Twist表达上调被逆转，FN刺激诱导Tca8113细胞的侵袭活动被抑制。提示，Calpain2可能参与FN诱导的模型细胞Tca8113发生EMT。研究报道，作为Calpain2调节亚基的Calpain4可通过Wnt/βcatenin信号通路的激活促进人黑素瘤细胞EMT［9］。在乳腺癌中，Calpain2可通过MAPK的介导调节乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移及黏附［10］。最新研究发现，Calpain2可能参与调节正常乳腺上皮细胞MCF-10A细胞EMT［11］。这些都提示Calpain2与EMT可能存在潜在的调控关系。而Calpain2参与调节口腔鳞癌细胞Tca8113为本研究首次发现，围绕Calpain2或其下游信号靶点进行研究可能为临床治疗口腔鳞癌提供实验依据。

文献已报道Calpain2参与了肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的调控［9-10，12］，但其具体的调控机制还未完全明了，有待于进一步的实验研究。因此，本实验组未来会对Calpain2下游信号靶点就行研究探索，为丰富Calpain2的生物学效应做出一定的努力。总之，本研究发现FN能诱导口腔鳞癌Tca8113细胞发生EMT，该作用可能与Calpain2蛋白表达上调相关。