降解滁菊茎秆产纤维素酶的红绶曲霉MFCJ鉴定

2019-10-16钱明敏许婷婷许慧敏

安徽农学通报 2019年18期

钱明敏章鹏许婷婷许慧敏孙寒罗侠孙星

（滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000）

纤维素作为地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，经纤维素酶降解之后可转化为食物、燃料和化学制品，应用十分广泛，涉及到人类的衣、食、住、行等方方面面，是人类拥有的最具前景的资源之一［1］。纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。从类别上看，它属于核苷水解酶类，广泛存在于微生物和一些植物体中。而由于在纤维素酶生产过程中，存在纤维底物需求高度复杂、生产成本较高、纤维素酶活力较低、生产周期长等问题，导致当前纤维素酶制造产业在我国依然处于研究开发的阶段。因此，寻找、开发活力高、针对性强的产纤维素酶菌株是高效利用纤维素资源的关键［2-3］。

滁菊作为全国4大白菊之首，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美誉。在滁州，每年滁菊收获后都会残留大量的茎秆，茎秆直接还田后由于其高纤维素含量，造成土壤碳氮比失调、土壤板结等一系列问题。本研究通过对滁菊种植地地上中产纤维素酶分解菌进行分离与筛选鉴定，旨在筛选出能最大程度地降解滁菊茎秆的高产纤维素酶菌株。

1 材料与方法

1.1 采集样品在滁菊种植田中间部位对样本土壤进行“S”型采样，为了避免实验的偶然性，共采取5处的土壤样品。

1.2 制备培养基以纤维素为唯一碳源的固体培养基：在500mL赫奇逊（hutchison）营养液中加入滤纸浆5mL，琼脂粉10.00g。赫奇逊营养液：磷酸二氢钾1.00g，氯化钠0.10g，硝酸钠2.50g，硫酸镁0.30g，三氯化铁0.01g，氯化钙0.10g，蒸馏水1000mL，pH7.2左右。滤纸浆：定量撕碎的滤纸和适量水于烧杯中煮沸1h，并用玻璃棒不断搅拌，制成悬浮物备用。纤维素-刚果红培养基：百思生物公司购买。产酶培养基：滁菊茎秆粉末26.00g，硫酸铵1.89g，硫酸二氢钾5.31g，硫酸镁0.30g，氯化钙0.30g，吐温1.50mL，硫酸亚铁0.005g，硫酸锌0.0014g，硫酸锰0.0016g，氯化钴0.002g，蒸馏水1000mL。

1.3 初筛产纤维素酶菌种称取土壤样品1g，放入含99mL无菌水的锥形瓶中，振荡摇匀。然后按10倍浓度梯度分别稀释成10-3，10-4稀释液。将已灭菌的以纤维素为唯一碳源的培养基倒入培养皿中，待其冷却凝固后，用无菌移液管吸取0.2mL稀释液倒入平板上，再用玻璃涂布棒在平板表面轻轻涂抹以至均匀，最后将平板放置于30℃左右的恒温培养箱中倒置培养48h。

1.4 复筛产纤维素酶菌种将初筛分离得到的菌种用接种环划线到纤维素-刚果红培养基上，再将上述平板置于恒温培养箱中培养2～3d后，观察是否有透明圈生成。

1.5 分离纯化目的菌株将上述4种产生透明圈的菌落用接种环分离纯化，接种划线至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上，再将这些平板置于恒温培养箱中培养48h。

1.6 制备斜面固体培养基在100mL的赫奇逊（hutchison）中加入滤纸浆1mL，琼脂粉2.00g，制成培养基，在4个试管中分别倒入15mL已配好的培养基，倾斜15°待其冷却凝固后接种上述已纯化菌落，放入冰箱中冷藏保存，以便备用。

1.7 制备粗酶液将上述已分离纯化的菌株接种到产酶培养基中，于28℃下在振荡水浴锅中恒温培养5d，转速为160r/min。然后，将发酵液经5000r/min的转速离心10min，除去菌体后保留上层清液，即为所得粗酶液。

1.8 测定酶活力采用分光光度法测定酶液吸光值。以3，5-二硝基水杨酸（DNS）为显色剂在550nm处测得不同浓度葡萄糖的吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，以分光光度计测得的吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线。0.5mL各酶液分别加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液于50℃水浴锅中水浴糖化30min，取出后，沸水浴得糖化液，冷却，再分别加入2mLDNS显色剂，沸水浴中煮沸10min，待其冷却，加水定容稀释5倍，振荡混匀后，在550nm处测得各酶液的吸光值。纤维素酶活力单位=（N×OD550值对应的葡萄糖量）/（30×1）。通过标准曲线求得各菌种在550nm处OD值所对应的葡萄糖量，代入公式即得每克各菌种中纤维素酶活力单位。

1.9 鉴定目的菌株将2号菌株接种至稍厚的平板中，实用载玻片进行插片培养数日后，拿去做镜检观察，并将接种有2号菌株的斜面固体培养基寄往通用生物公司测定其DNA序列。根据所得到测序目的序列到NCBI进行Blast比对，并构建发育树。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌种的初筛从滁菊产地的土壤样品中，以纤维素为唯一碳源的培养基筛选微生物。筛选到5种可以在以纤维素为唯一碳源的培养基上生长。

2.2 产纤维素酶菌种的复筛和分离纯化将初筛分离得到的菌种用接种环划线到纤维素-刚果红培养基上，再将上述平板置于恒温培养箱中培养2～3d后，观察有透明圈生成。结果发现有4种菌落周围生成了清晰可见的透明圈，给其编号为1，2.3，4。

2.3 产纤维素酶菌种的酶活力不同浓度的葡萄糖标准液在550nm处的吸光值并得到葡萄糖标准曲线（图1）。

图1 不同浓度的葡萄糖标准液在OD550处的吸光值

利用分光光度计测出样品在550nm处的吸光值，求得每克各菌种中纤维素酶活力单位（表1）。比较表1中纤维素酶活力大小，得出2号为筛选的目的菌株。

表1 各菌种的酶液在550nm处的吸光值

2.4 产纤维素酶菌株镜检鉴定对2号菌株进行显微镜观察：目的菌株菌落黄绿色，外观干燥不透明，质地疏松，呈丝绒状，在显微镜下观察清晰可见顶囊球形或烧瓶形，分生孢子呈近球形或椭圆形（图2），初步鉴定为霉菌［11］。

图2 目的菌株在高倍显微镜下的镜检结果（放大倍数：上：10×10；下：10×40）

2.5 产纤维素酶菌株分子鉴定1%的琼脂糖鉴定（如图3～4）并使用Axygen凝胶回收试剂盒回收所需PCR产物片段。PCR产物进行测序，跑3730XL测序仪，根据所得到测序目的序列到NCBI进行Blast比对（图5），并构建发育树（图6）。经对比后发现目的菌株与红绶曲霉亲缘关系最为接近，故将其命名为Aspergillus nomius.MFCJ。

菌株MFCJ的序列如下：

TTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGG GTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAGAATG GTTGTTTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTA CAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGAT CGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTAGGGCCCGTCCCC CCCCGGAGAGGGGGACGACGACCCAACACACAAG CCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCG TTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCAC ACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG CCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACT GATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCGTT CAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCG GGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCC CGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGA GGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATG ATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGGAAGG