白藜芦醇抑制NF-κB通路对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用

何梅英，陈文婷

0 引言

脓毒症是临床常见的急危重症，其激发的全身炎症综合征是伴发多器官功能障碍的重要原因，其中肺脏是最易受损的器官。脓毒症早期往往可导致急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)的发生。ALI是急性呼吸窘迫综合征的早期阶段，如果不加干涉病死率高达50%～70%[1]。脓毒症伴发的全身严重炎症反应是急性肺损伤的主要发病机制，抑制炎症，保护肺功能也是目前预防脓毒症大鼠急性肺损伤的主要策略[2]。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种非黄酮类多酚化合物，为中药虎杖根茎的提取物，药理学研究显示，白藜芦醇具有抗肿瘤、调节血脂、抗氧化、抗炎等多种功效[3]。研究显示，白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤具有保护作用[4]。本研究观察白藜芦醇对脓毒症大鼠核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路的影响，探讨白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性成年SD大鼠由海南医学院动物实验中心提供，体重200～250 g，共60只，无菌饮水和饲料适应性喂养3 d后，进行造模处理。

1.2 实验造模 60只SD大鼠随机分为假手术组(20只)和造模组(40只)，造模组SD大鼠采用盲肠结扎穿刺术制备脓毒症模型[5]，方法如下：经腹注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，备皮消毒后，沿腹正中线做1 cm切口，游离盲肠末端，距盲肠末端1 cm处用4号无菌丝线结扎，27号针头贯通盲肠肠管，挤出少量肠内容物后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合关闭腹腔，术后皮下注射生理盐水抗休克治疗。假手术组SD大鼠仅分离盲肠，不做结扎和穿孔。术后40只造模SD大鼠随机分为脓毒症模型组和白藜芦醇干预组，每组20只，干预组大鼠于术后60 min尾静脉注射无菌白藜芦醇(40 mg/kg，美国Sigma公司)，其余大鼠尾静脉注射等量生理盐水。24 h后进行相关指标检测。

1.3 大鼠外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的检测 ELISA法检测大鼠外周血TNF-α、IL-6的表达。所有实验SD大鼠造模前及造模24 h后抽取尾静脉血液0.5 ml，1 000 r/min离心10 min，分离上层血清，送检验科使用TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒(武汉华美公司产品，批号：20171104)，加入相关试剂，DNM-9606酶标仪(北京普朗新技术有限公司)检测各样品的吸光度值变化，对照试剂盒提供的标准品，计算出各样品TNF-α和IL-6的相对表达水平。

1.4 肺损伤评分 各组大鼠造模24 h后，断颈处死，开胸留取肺组织，4%甲醛固定后，送检验科经石蜡包埋、脱水后，制作HE染色切片，显微镜下进行肺损伤评分，参照卜克等[2]的方法，从肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、炎症细胞浸润、透明膜形成5个方面，按照正常(0分)、轻度(1分)、中度(2分)、重度(3分)进行评分，总分15分。

1.5 肺组织细胞细胞核P65的Western blot检测 各组大鼠造模24 h后，断颈处死，开胸留取50 mg肺组织，液氮下研磨后，PBS洗涤2次，核蛋白提取裂解缓冲液，冰上60 min，10 000 r/min离心20 min，PBS洗涤沉淀2次，加入蛋白裂解液提取核蛋白，Bradford法定量蛋白浓度后，取10 μg核蛋白加入SDS-PAGE凝胶样品孔中，电泳后电转至PVDF膜，加入羊抗鼠P65抗体(美国Cell signal公司)孵育过夜后，加入马抗羊辣根过氧化物酶标记二抗(上海康城生物科技技术有限公司)，化学发光显示目的条带，扫描条带后使用Quantity One V 4.3.0软件测定条带光密度值，以组蛋白为内参计算各样品的相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，组间相互比较采用LSD检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组术后存活率比较 假手术组无大鼠死亡，存活率为100.0%；脓毒症模型组死亡8只，存活13只，存活率为65.0%；白藜芦醇干预组死亡4只，存活16只，存活率为80.0%；3组存活率比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中假手术组存活率显著高于白藜芦醇干预组(P<0.05)，白藜芦醇干预组显著高于脓毒症模型组(P<0.05)。

2.2 三组肺组织损伤的比较 假手术组、脓毒症模型组和白藜芦醇干预组肺损伤评分分别为1.84±0.42、11.62±2.26和5.27±1.43，3组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中假手术组肺损伤评分显著低于白藜芦醇干预组(P<0.01)，白藜芦醇干预组显著低于脓毒症模型组(P<0.01)。

2.3 三组大鼠外周血TNF-α、IL-6表达的比较 假手术组、脓毒症模型组和白藜芦醇干预组造模前TNF-α和IL-6表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模24 h后，3组TNF-α和IL-6表达均显著升高，但假手术组TNF-α和IL-6表达显著低于白藜芦醇干预组(P<0.01)，白藜芦醇干预组显著低于脓毒症模型组(P<0.01)。见表1。

表1 三组SD大鼠造模前后TNF-α和IL-6表达比较(μg/ml)

注：与假手术组比较，**P<0.01；与脓毒症模型组比较，▲▲P<0.01；与造模前比较，##P<0.01

2.4 三组造模24 h后肺组织细胞细胞核P65的表达 经灰度扫描后，假手术组、脓毒症模型组和白藜芦醇干预组肺组织细胞核P65相对灰度值分别为0.14±0.02、0.57±0.14、0.32±0.08，各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。其中假手术组肺组织细胞细胞核P65表达显著低于白藜芦醇干预组，白藜芦醇干预组显著低于脓毒症模型组。见图1。

图1 3组SD大鼠造模24 h后肺组织细胞核P65表达的Western blot检测

3 讨论

20%的急性肺损伤是由脓毒症时炎症介质紊乱引起的[6]。TNF-α和IL-6是常见的炎症因子，这些炎症介质一方面参与到组织损伤中，另一方面又可以激发下游反应，导致炎症的级联效应[7]。白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，属于植物类抗毒素，白藜芦醇或含白藜芦醇食物的抗炎作用已被大多数实验所证实[8]，余应喜等[9]研究显示，白藜芦醇抑制脓毒症大鼠巨噬细胞炎症蛋白-2、IL-10、IL-18表达后，可以发挥对急性肺损伤的保护作用；周继红等[10]研究发现，白藜芦醇可以下调脓毒症大鼠肺组织HGMB1和TLR4 mRNA表达，发挥对急性肺损伤的保护作用。本研究也显示，白藜芦醇干预组肺损伤评分显著低于脓毒症模型组，说明白藜芦醇对脓毒症时肺损伤有保护作用。

NF-κB信号通路是调节TNF-α和IL-6的重要炎性通路，脓毒症时NF-κB信号通路会被激活[11]。邹宪宝等[12]研究显示，脓毒症血清可以激活人肺血管内皮细胞NF-κB信号通路，激发炎症反应，损伤血管内皮细胞。NF-κB信号通路激活时P65蛋白会分离出来，进入细胞核，发挥转录因子的作用，因此，检测细胞核中P65的表达可以反映NF-κB信号通路的激活。本研究结果表明，假手术组肺组织细胞细胞核P65表达显著低于白藜芦醇干预组，白藜芦醇干预组显著低于脓毒症模型组，说明脓毒症大鼠肺组织细胞中NF-κB信号通路处于激活状态，而且白藜芦醇对这种激活有抑制作用。邱荣宗等[13]的研究也发现白藜芦醇对脓毒症大鼠NF-κB通路具有调节作用。TNF-α和IL-6炎症因子检测结果表明，白藜芦醇干预组TNF-α和IL-6表达显著低于脓毒症模型组，提示白藜芦醇通过调节NF-κB通路，抑制脓毒症大鼠的炎症反应。

综上所述，白藜芦醇通过调节脓毒症大鼠的NF-κB通路，抑制炎症反应，发挥了对肺损伤的保护作用。