高通量测序技术在无创性产前胎儿染色体缺失重复检测中的应用

吴玥丽 张琳琳 李 琳 李 莹 赵 晖 赵 玲 朱重阳

河南省妇幼保健院(郑州大学第三附属医院)(郑州，450052)

无创产前检测(NIPT)主要用于染色体非整倍体异常的产前检测，以21-三体综合征最为准确(81.6%)[1]。随着NIPT技术的发展，逐渐用于染色体缺失或重复的产前检测，但检测准确率不高，由于染色体缺失或重复类型繁多，复杂多变，且常有新发突变的产生，导致检测难度较大。高通量测序技术运用于无创产前检测，可测序分析胎儿DNA并最终确定胎儿有无先天性遗传病[2]。本研究探讨高通量测序技术在无创性产前胎儿染色体部分缺失重复检测中应用的可行性和检测可靠性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2016年8月—2018年8月本院行无创产前检测并自然受孕单胎孕妇5170例临床资料，孕妇年龄(30.1±10.3)岁(21～40岁)。入选标准：①高龄(≥35岁)；②血清学筛查异常；③不适宜做侵入性检查。研究经本院伦理委员会审查批准，孕妇及其家属知情并签署同意书。

1.2 无创产前检测

对5170例孕妇进行产前咨询，在孕12～22周采集外周静脉血，抗凝，提取血浆中cff DNA，进行单末段测序和实验室文库构建。采用新一代Ion Torrent测序平台测序后收集每个样本获得DNA序列信息，比对人类基因组参考序列。应用生物信息统计学方法检测样本中存在的染色体缺失、重复，将参考基因组分解为reads数相等的300000个滑动窗口，计算相等窗口的reads数并与平均reads个数的比值定义为相对reads数。采用最小二乘法得到GC含量和相对reads数的线性关系。动态阈值法和二次元分割算法预测胎儿染色体缺失或重复的断裂点，判断胎儿染色体异常类型。

1.3 染色体核型分析及微阵列分析

对无创产前检查提示染色体缺失重复及性染色体异常者行产前遗传咨询，经孕妇及其家属知情同意后，于孕18～24在超声引导下行羊膜腔穿刺术。取羊水标本，一份行常规培养获取中期细胞分裂相，细胞培养、制片、阅片， G显带进行核型分析，按照ISCN2016进行核型描述；一份羊水标本离心使用AffymetrixCytoScan 750K芯片检测提取DNA，通过扩增、酶切等，与AffymetrixCytoScan 750K芯片进行杂交、洗涤，芯片扫描系统和软件处理分析数据。

2 结果

2.1 检测情况

5170例高危孕妇中，高通量测序技术检测检出27例常染色体缺失重复异常和12例性染色体异常，经产前咨询后38例(27例常染色体异常、11例性染色体异常)接受了羊水穿刺胎儿染色体核型分析及微阵列分析。

2.2 两种方法检测常染色体异常符合情况分析

27例常染色体异常的孕妇羊水穿刺胎儿染色体核型及微阵列分析，检出11例染色体异常，其中9例染色体微阵列结果符合无创性产前检测结果，2例不符，微阵列结果提示为多态性，符合率33.3%(9/27)。见表1。

表1 两种方法检测常染色体异常结果对比

序号NIPT 染色体微阵列异常染色体微阵列分析411号染色体缺失arr11q24.1q25(121,302,928 134,937,416)x111q24.1q25区段检出13634Kb缺失片段,在ISCA数据库中检索到多个相似片段,均提示为致病性,相关临床表现为全身发育迟缓、心脏发育异常、呼吸窘迫等513号染色体重复arr13q11q12.12(19,436,286 25,437,825)x313q11q12.12区段检出6002Kb重复片段,在ISCA数据库中检索到相似片段,提示为致病性613号染色体重复arr13q12.12q12.2(24,768,204 28,346,964)x313q12.12q12.2区段检出3579Kb重复片段,临床意义不明确,倾向良性,建议父母CMA验证713号染色体缺失arr13q33.3q34(109,723,745 115,107,733)x113q33.3q34区段检出5384Kb缺失片段,ISCA数据库提示为致病性,相关临床表现为生长发育迟缓。814号染色体缺失arr14q21.1(40,922,261 43,403,193)x114q21.1区段检出2481Kb缺失片段,在DECIPHER数据库中检索到1个相似片段,提示为意义不明确916号染色体增多arr16p13.3p13.11(94,807 15,556,797)LOHarr16q23.1q24.3(74,839,519 90,146,366)LOH临床意义不明确,建议父母行CMA验证做UPD来源分析102号染色体缺失,15号染色体重复重复arr7q11.21(64,612,879 65,148,399)x17q11.21区段检出536Kb缺失片段,在DGV数据库中检索到多个相似片段,提示为多态1113号染色体缺失arr16p11.2(31,991,160 33,863,672)x316p11.2区段检出1873Kb重复片段,提示为多态

2.3 两种方法检测性染色体异常符合情况分析

无创产前检测显示12例性染色体异常孕妇中有1例拒绝羊水穿刺检查，余11例行羊水穿刺胎儿染色体核型分析，7例性染色体异常结果符合无创性产前检测,符合率63.6%(7/11)，见表2。1例男性胎儿提示X染色体数目减少，经验证孕妇为46,XX/45,XO嵌合体。

表2 两种方法检测常染色体异常结果对比

3 讨论

胎儿染色体异常检测的金标准是对胎儿细胞进行染色体核型或微阵列检测，但该方法是通过穿刺术获取胎儿组织或细胞，不仅存在技术难度，且会增加孕妇流产和宫内感染和羊水渗漏等发生风险[3]。随着二代测序技术的发展，运用高通量测序技术的无创产前检测技术正在逐步积累临床经验，检测可靠程度也得到一定范围内的证明[4-6]。有研究表明高通量测序技术的无创产前检测对于18-三体综合征和21-三体综合征的检测准确率可达到97.4%和99.4%[7]。但对染色体拷贝数变异检测灵敏度和特异性都不高，且缺乏大量临床数据。2012年Jensen等[8]成功检测出两个胎儿22号染色体上3.0Mb的缺失，但实验要求cffDNA占母血中总 DNA的10%以上，测序深度4倍。Yu等[9]检测出6例致病性CNV病例，证实通过提高测序深度，可检测低至1Mb左右胎儿染色体拷贝数变异，但如果达到95%敏感度，每例样本需读取240M读数。Srinivasan等[10]随后研究了11位胎儿核型异常的孕妇，测序深度达200M reads，证实高通量测序平台可检测出所有20-三体综合征以及微重复微缺失，并且通过提高测序深度，最高可达100KB分辨率，发现了诸多在孕中期染色体核型分析不能发现的微小病变。以上研究表明，通过高通量测序技术检测胎儿染色体缺失重复要求较高的测序深度及较高的cffDNA浓度。Yin[11]团队利用半导体测序技术，在不同测序深度及不同cffDNA浓度条件下，检测了1476例超声异常胎儿的孕母外周血，评估高通量测序技术无创检测胎儿染色体缺失重复的临床应用价值，研究发现检出率与cffDNA在母血浆中的浓度比例及测序深度呈正相关，在3.5M reads时可检出71.8%的染色体片段异常，检测5Mb以上染色体片段的灵敏度98.15%，特异度97.84%，假阳性率2.16%，假阴性率1.85%；测序深度10M reads时，检测1Mb以上染色体片段灵敏度97.08%，特异度 98.6%，假阳性率1.99%，假阴性率2.92% 。然而测序深度的提高大大增加了检测成本，因此有研究通过改变计算方法提高检测灵敏度。Chen等[12]运用动态阈值、二次元分割算法以及GC偏倚纠正方法，开发了低深度测序(0.08×)母体外周血DNA检测>10Mb胎儿染色体缺失重复的方法，在1311例样本中检出4例致病片段，为9.01～28.46Mb，检测敏感性100%，特异性99.92%，假阴性率0%。Rampa等[13]设计了一种新的Hidden Marlov模型，将SNP位点等位基因不平衡性、父母基因型相近的SNP位点信息和测序深度相结合，检测硅片中模拟cffDNA浓度13%的母体外周血模型，可检出90%片段>4.4Mb的样本，检出40%片段在50～400Kb的样本。由此可见，运用高通量测序技术无创检测胎儿染色体片段异常受测序深度、胎儿cffDNA浓度、测序方法、计算方法等多种因素的影响。

本研究运用高通量测序技术在5170例高危孕妇中共检出了胎儿染色体缺失重复异常27例，经介入性产前诊断检出染色体异常11例，9例结果符合。本研究采用高通量测序深度为0.1×，每例标本数据为4.2 M reads，检出染色体片段2.48Mb～60Mb，该测序条件下对染色体缺失重复的检测存在较高的假阳性，可能与孕妇血浆中胎儿cffDNA含量变化大、cffDNA片段大小及完整性不确定有关。测序深度较低，测序方法及计算方法不够优化也会导致假阳性的产生[14-16]。

NIPT对胎儿性染色体非整倍体检出有较高敏感性，本研究中无创产前检测显示性染色体异常孕妇12例中除1例拒绝进一步羊水穿刺外，11例行羊水穿刺胎儿染色体核型分析， 7例结果符合。1例男性胎儿提示X染色体数目减少，经验证孕妇为46,XX/45,XO嵌合体，提示无创产前检测受母体自身DNA影响较大，当出现性染色体异常结果时，应考虑是否存在母体嵌合因素影响。此外，由于X染色体GC含量较高造成测序偏移、性染色体之间的高度同源性、Y染色体含有较多的回文结构、Y染色体长度变异以及胎儿性染色体存在嵌合可能等，也加大了无创产前诊断胎儿性染色体非整倍体分析的难度[17]。除上述问题外，染色体核型分析受人工环境与人体内环境影响较大，染色体核型分析结果有一定差异[18]。总之，无创产前检测提示性染色体异常时还需进一步染色体核型分析，如果染色体核型分析结果与无创产前检测符合，则可确定诊断。

综上所述，综合NIPT的各种利弊，虽然其临床符合率不高但对孕妇和胎儿没有损伤，临床更易被孕妇接受，对产前胎儿染色体部分缺失重复的筛查有一定临床价值，预测胎儿性染色体异常也有一定价值。利用高通量测序技术检测孕妇血浆中cffDNA诊断胎儿染色体缺失重复是可行的，但由于cffDNA在母血中浓度较低、测序深度等造成成本过高以及较高的假阳性率，目前该技术仍处于研究中，需进一步降低检测的假阳性及假阴性。随着生物信息技术的快速发展以及测序成本逐步降低，期望该技术将很快应用于临床检测。