内蒙古兴安盟地区布鲁氏菌流行株种型鉴定和体外药物敏感性分析

2019-10-15袁海涛崔建楠冯丽平郭长山吴金泉刘伟双曲振红蔡洪涛

中国人兽共患病学报 2019年9期

袁海涛,崔建楠,彩花,冯丽平,王红,郭长山,吴金泉,刘伟双,曲振红,蔡洪涛

布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病),是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌引起的一种人兽共患病。布病给流行国家和地区造成经济损失并危害人类健康[2]。2018年兴安盟地区人间布病发病人数和发病率均居于内蒙古自治区各盟市首位,布病防控工作形势严峻,目前对内蒙古兴安盟地区布病患者的感染菌种型及细菌对常用药物的敏感性的研究,尚未见报道。该研究选择兴安盟布病发病率较高的3个旗县和1个人口密集的旗县分离的布鲁氏菌,明确布鲁氏菌流行的主要种型,了解菌株的耐药菌谱,为临床治疗提供指导。

1 材料与试剂

1.1 菌株来源 28株布鲁氏菌是2018年5月-12月,从兴安盟地区200名布病患者血样中分离培养获得,其中科右中旗9株,突泉县8株,科右前旗6株,乌兰浩特市4株,扎赉特旗1株。3株标准菌株羊16M、牛544A、猪1330S来源中国疾病预防控制中心;药敏质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213,来源于温州市康泰生物科技有限公司。

1.2 试剂布氏琼脂肉汤(批号8129671)由美国BD公司生产,布氏琼脂(批号7121860)由美国BD公司生产,32GN阴性杆菌鉴定卡(批号2410565203)由法国梅里埃公司生产,BCSP31基因的PCR检测试剂(批号:EB05KAC422),由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,布鲁氏菌鉴定用用噬菌体Tb、Tb104RTD、BK2,单项特异性血清A和M由中国疾病预防控制中心提供,药敏板包括13种抗生素:链霉素、多西环素、利福平、四环素、阿奇霉素、环丙沙星、复方新诺明、头孢曲松、氧氟沙星、莫西沙星、妥布沙星、庆大霉素,由温州市泰康生物科技有限公司生产(批号RL14140)。药敏试验使用肉汤微量稀释MIC法,试验程序和结果判读按临床和美国实验室标准化研究所(CLSI)制定的抗菌药物敏感性执行标准进行。

1.3 样本的采集、培养和分离病人样本的采集:无菌方法用BD BACTEC血培养瓶采集疑似布病病人血液样本8～10 mL,置于美国BD FX-40全自动血培养系统中培养7 d,当细菌生长时自动提示,若无细菌生长,血培养瓶高压处理。将阳性血培养瓶中培养液接种于血平皿上,至37℃温箱中培养2 d后观察和分离典型菌落。

1.4 布鲁氏菌的鉴定

1.4.1 显微镜检查将可疑菌落涂片用甲醛固定后进行革兰染色,用油镜观察。

1.4.2 布鲁氏菌属的鉴定[3]生化鉴定:将纯菌配置成0.5麦氏浊度的菌悬液,使用32GN阴性杆菌鉴定卡,通过VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统进行生化鉴定。分子生物学鉴定:用世界动物卫生组织(OIE)推荐的BCSP31基因的PCR方法[4],在属的水平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株。ABT PCR毛细管电泳系统检测。

1.4.3 布鲁氏菌种型的鉴定通过染料抑制试验(染料滤纸片方法)、CO2需求试验、H2S生成试验、单因子血清凝集试验(A和 M)、噬菌体Tb、Tb104RTD、BK2裂解实验鉴定布鲁氏菌的生物种型。

1.5 药敏试验[5-7]

1.5.1 方法依据采用2018CLSI-M100-S28和WST 639-2018推荐的肉汤微量稀释法。使用不含添加剂的布鲁氏肉汤p H7.0±0.2。

1.5.2 试验方法无菌操作,选取布氏琼脂平板上纯培养菌落,被测菌株和相应质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213配制0.5麦氏浊度单位的菌悬液,作为初始接种物菌悬液。制备浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液,经1∶200稀释后,向每孔中加100μL(最终接种物浓度约为5×104CFU/mL),密封后置35℃普通空气孵箱中,孵育48 h观察结果。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验成立。记录抑制细菌生长的最高药物浓度MIC值。

2 结果

2.1 培养和分离 200份血培养瓶28份仪器报警阳性,28份样本在血平皿上生长为较小,灰色,圆形,稍隆起,边缘整齐,不溶血的小菌落。

2.2 鉴定结果

2.2.1 显微镜检查 28株菌革兰染色,油镜观察细菌的形态为阴性球杆菌、染色弱、细沙样。

2.2.2 生化鉴定 28株菌经 VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统鉴定均为布鲁氏菌属(表1)。

表1 28株布鲁氏菌生化鉴定结果Tab.1 Biochemical identification results of Brucella(28 strains)

2.2.3 分子生物学鉴定 28株菌经BCSP31-PCR扩增后,用毛细管电泳均有清晰的约223 bp大小的基因片段。

2.2.4 种型鉴定用传统经典的方法进行种型鉴定,28株布鲁氏菌H2S试验、Tb噬菌体裂解试验、Tb104RTD噬菌体裂解试验均为阴性,Bk2噬菌体裂解试验、硫堇抑菌试验、复红抑菌试验均为阳性,通过试验判定28株菌均为布鲁氏菌羊种。进一步通过A M R血清凝集鉴定羊布鲁氏菌的菌型(表2),结果显示:羊种布鲁氏菌为兴安盟主要的流行株,其中羊种3型最多(64.29%),羊种1型其次(35.71%),见表2。

2.2.5 药敏结果本研究对28株布鲁氏菌分离株中的25株菌(3株菌送中国疾控中心,未留药敏试验菌株)进行了体外药物敏感性研究,按照CLSI规定的MIC的结果判定方法,本次使用的药敏质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213,对各药物的MIC检测值在CLSI规定的标准菌株质控值允许的范围内。

表2 28株布鲁氏菌种型鉴定结果Tab.2 Species identification of Brucella(28 strains)

25株菌均分离自病人血液样本;初诊患者占78.57%(22/28),临床表现以发热、多汗、关节疼痛、头痛、乏力居多;75.00%(21/28)的患者就诊前无用药史,25.00%(7/28)的患者就诊前用过左氧氟沙星、头孢曲松或中蒙药等药物治疗,见表3。

实验结果表明25株布鲁氏菌对阿奇霉素、复方新诺明耐药菌株数分别为100%(25/25)和20.0%(5/25);部分菌株对利福平、头孢曲松的药物敏感性降低[10],均为16%(4/25)。所有菌株对多西环素、四环素、庆大霉素、链霉素均表现为敏感,妥布霉素、卡那霉素找到或未在文献中搜索到判定标准,其检测的MIC值仅为相关研究提供一些参考。

3 讨论

由于布鲁氏菌的致病性以及既往实验室感染的报道,所有标本的处理均应在二级及以上级别的生物安全柜内进行,疑似布鲁氏菌涂片染色前要用甲醛固定(以杀灭布氏菌)再进行涂片[1]。

本研究分离布鲁氏菌28株经VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统鉴定均为布鲁氏菌属。全自动微生物分析系统鉴定速度快,可靠性较高,确定布鲁氏菌属的鉴定指标为L-脯氨酸芳胺酶(Pro A)、酪氨酸芳胺酶 (Tyr A)、尿素酶(URE)、氨基乙酸芳胺酶(Gly A);区分羊种布氏菌的指标为ELLMAN(ELLM)[3]。

鉴于目前,仍没有一种PCR方法可以将所有的布鲁氏菌鉴定到型[8],本研究所有布鲁氏菌菌株的分型均基于传统的微生物方法(生长、产尿素酶和硫化氢、对染料碱性品红和硫蛋白的敏感性以及噬菌体Tiblissi和 Weybridge的分解)[9]。传统的微生物方法对布鲁氏菌种型鉴定方法对布鲁氏菌进行生物种型鉴定,证实羊种布鲁氏菌为兴安盟主要的流行株,其中羊种3型最多(64.29%),其次是羊种1型(35.71%)。与2018年内蒙古乌兰察布市地区布鲁氏菌分型特征相似,其研究共分离布鲁氏菌116株,其中115株分离自人血,1株分离自羊脾;经3种方法鉴定全部为羊种布鲁氏菌,其中羊3型94株,羊1型22株;菌株分布于乌兰察布市境内的11个旗(县、市、区)及周边的内蒙古锡林郭勒盟、山西省大同市郊和河北省尚义县等地[10]。

本次研究的内蒙古兴安盟地区布鲁氏菌流行株对一线方案药物多西环素、庆大霉素、链霉素、四环素敏感;部分菌株对利福平、头孢曲松的药物敏感性下降,国外有文献报道,布鲁杆菌对利福平的敏感性降低,我国尚无关于耐药性的大规模研究[1]。由于CLSI尚未确定布鲁氏菌种MIC的折点,这些菌株不能自信地描述为中间抗性,尽管可能存在易感性降低。利福平的MIC值在1到4 mg/L之间已经报道过。SXT也得到了类似的结果[9]。本研究根据CLSI慢生细菌的解释标准,4株对利福平的MIC值为1.6 mg/L,为药物敏感性降低的菌株;25株菌对阿奇霉素全部耐药,这与2011年中国疾病预防控制中心对国内分离的69株羊种布氏菌进行12种抗生素的体外敏感性研究中对阿奇霉素、克拉霉素全部耐药的报告一致[5]。部分菌株对复方新诺明耐药,与2018年内蒙古乌兰察布地区的临床常用药物的敏感性研究一致,其实验表明布鲁氏菌对阿奇霉素、利福平和复方新诺明耐药菌株数分别为100%(85/85),1.0%(1/85)和7.0%(6/85)[10]。不同的是,根据CLSI慢生细菌的解释标准,本研究中的4株菌对头孢曲松的MIC值为4.0 mg/L,可能为药物敏感性降低的菌株。我国是抗菌药物应用大国,耐药性问题不容忽视,有待较大规模的调查以明确我国布鲁氏菌的耐药现状。