复发性早期妊娠丢失与叶酸代谢相关基因多态性关系的研究

崔 双，唐禹馨，侯海静

(1.舟山医院妇产科，浙江 舟山 316000；2.舟山妇幼保健院产科，浙江 舟山 316000)

妊娠丢失(pregnancy loss，PL)可出现在整个妊娠期间，其中胚胎开始发育的妊娠早期较为常见。早期妊娠丢失(early pregnancy loss，EPL)是指妊娠12周以前的妊娠丢失，包括流产和生化妊娠丢失[1]。结合我国相关研究，EPL在妊娠丢失中约占80%，最常见的有自发性流产，胚胎停育，胎死宫内等情况[2]。复发性EPL由于其病因复杂、预后较差和对孕妇身心健康的不良影响，一直受到学界关注。叶酸(即维生素B9)是一种水溶性的维生素，对促进胎儿神经细胞分化、预防胎儿的神经管畸形有重要作用。然而叶酸需要进行多重酶的催化作用才能产生活性，其中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)等属于关键酶，其基因位点的多态性易造成酶活性降低而导致叶酸代谢障碍，引发相关疾病[3]。有研究指出，部分妇女产生不良孕产结局与叶酸代谢相关酶基因多态性有关[4]。叶酸多聚谷氨酸是人体通过饮食而摄取的叶酸，需要在空肠中水解为叶酸单聚谷氨酸才能进入血液。我国地域辽阔，南北饮食差异巨大，而且机体对于叶酸的吸收代谢能力因人而异，所以人体叶酸代谢基因多态性也具有较大差异[5]。目前对于叶酸代谢相关基因多态性与不良妊娠结局的研究较多，但鲜见对复发性EPL的专门研究。本文旨在研究复发性EPL与叶酸代谢相关基因多态性的关系，为我国妊娠妇女的相关临床研究提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年4月至2018年4月在舟山医院和舟山妇幼保健院妇产科就诊的170例孕妇为研究对象。纳入标准：①年龄为20～35周岁，民族不限；②临床诊断为复发性EPL，指妊娠妇女在孕12周之前出现2次及以上的流产[6]；③了解研究内容并自愿签署知情同意书。排除标准：①有吸烟史、酗酒史；②患有肿瘤者或者其他严重的循环、血液等系统疾病；③合并子宫畸形、宫颈功能不全、染色体异常、妊娠期并发症或已知胎儿畸形。符合入组标准的复发性EPL孕妇84例为研究组，选取正常分娩或者是妊娠结局正常的孕妇86例为对照组，两组的年龄、身体质量指数(BMI)、民族、孕次、产次比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组人口学及病情资料比较结果

1.2研究方法

1.2.1收集研究对象信息

成立复发性EPL与叶酸代谢相关基因多态性研究的团队，团队成员进行统一的培训，培训合格后方可开展本项研究。培训的主要内容包括：妊娠妇女肘静脉血采样方法，数据的采集、录入、统计学方法。收集信息内容包括：①研究对象的一般情况资料，如年龄、BMI、民族等；②妊娠妇女孕期情况、孕产史、家族史等。

1.2.2采集DNA的方法

由专业团队成员采样妊娠妇女肘晨间空腹静脉血4mL，利用PCR-荧光探针试剂盒抽提研究对象样本的DNA。

1.2.3检测方法

运用PCR和荧光法进行亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的C677T、A1298C位点、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因的A66G位点的SNP分型。Taqman-MGB探针所在的位置见表2。PCR每个反应体系为10μL总体积，包含20ng/μL×1μL的DNA模板、5μL的2×Taqman Universal Master Mix，0.5μL的20×Taqman-MGB探针和3.5μL去离子水。PCR反应条件为95℃ 10min，第一步在92℃ 15s、60℃ 1min条件下进行20个循环的扩增，第二步在89℃ 15s，60℃ 90s条件下进行30个循环的扩增。反应结束后，在ABI荧光PCR仪器(ABI 7900型，美国应用生物系统公司生产)上读取样品孔中的终点荧光，利用配套的分析软件计算各个样本的基因分型结果。

表2 Taqman-MGB探针位置

1.3统计学方法

2结果

2.1两组MTHFR基因的C677T比较

两组MTHFR基因C677T中CC型、CT型和TT型分布比较差异有统计学意义(χ2=7.212，P=0.027)，见表3。

表3 两组MTHFR基因C677T分布的比较结果[n(%)]

2.2两组MTHFR基因的A1298C比较

两组MTHFR基因A1298C中AA型、AC型、CC型分布比较差异有统计学意义(χ2=6.458，P=0.038)，见表4。

表4 两组MTHFR基因A1298C比较结果[n(%)]

2.3两组MTRR基因的A66G比较

两组MTRR基因A66G中AA型、AG型、CG型分布比较差异有统计学意义(χ2=7.093，P=0.029)，见表5。

表5 研究组与对照组MTRR基因A66G比较结果[n(%)]

3讨论

3.1复发性妊娠丢失的流行病学研究

复发性妊娠丢失是指孕妇发生自发性流产、胚胎的停育、胎死宫内的情况连续发生两次或者两次以上[6]。引起妊娠妇女复发性EPL的原因与多种因素有关，主要包括：染色体异常、遗传相关因素、妊娠妇女内分泌及免疫功能紊乱等。妊娠丢失后再次妊娠的成功率仅为37%，胎死宫内的发生率为32%，妇女出现自然流产的发生率也达到28%[7]。相关流行病学研究显示，妊娠丢失的患者中37%～44%具有较为明确的原因，大部分妊娠丢失的原因尚无法解释[8]。复发性EPL是早期妊娠不良结局中最为常见的一种，并且引发其产生的原因较多、较为复杂，如：染色体的异常、妊娠妇女合并有全身性的疾病、感染因素、内分泌因素、妊娠早期接受腹部手术、胎儿附属物(胎盘、脐带)等因素[9]。我国复发性EPL的发生率呈上升的趋势，值得医护人员的关注。

3.2叶酸代谢相关基因多态性的作用

叶酸是妊娠妇女体内极其重要、不能缺少的营养物质，其具有极其重要的生理作用，包括DNA的合成、甲基化、人体生长发育、基因表达等多个方面。同时叶酸对胎儿中枢神经系统发育有重要作用，相关代谢基因与妊娠妇女子痫前期、胎盘早剥及复发性流产等不良妊娠结局具有高度相关性[10]。妊娠妇女对叶酸的需求是普通人对叶酸需求的4倍，人体内众多酶系与叶酸的转运、代谢有关，而其中叶酸代谢的关键酶是MTHFR和MTRR两种。关键酶的基因在不同的国家、地区的人群中具有多态性[11]。当其发生突变时，会使酶的活性发生相应的改变，从而导致叶酸的代谢发生改变，并导致活性叶酸在妊娠妇女的体内水平异常。妊娠妇女MTHFR基因最为重要，在人体染色体上可以编码氨基酸的数量为656个，位置是1p36.3，一共包括了外显子11个，内含子10个。MTHFR基因编码的蛋白质可以对5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸进行转化。近年的研究发现，MTHFR基因发生的多态性突变位点已经达到了近20种，其中最为重要的突变位点是C677T位点及A1298C这两个位点[12]。C677T多态性突变后，表现的基因型有3种，分别为：CC型、CT型及TT型。A1298C多态性突变后，表现的基因型有3种，分别为：AA型、AC型及CC型。MTRR基因的A66G多态性突变后，表现的基因型有3种，分别为：AA型、AG型和GG型[13]。

3.3复发性EPL与叶酸代谢相关基因多态性的关联

本研究结果表明研究组MTHFR基因C677T位点的CC型、CT型和TT型基因分布，A1298C位点的AA型、AC型、CC型基因分布和MTRR基因A66G位点的AA型、AG型、CG型基因分布均高于对照组，这与国内的相关研究结果相似[14-15]，其中研究组的TT型、CC型和CG型分布均高于既往报道，提示该3种基因型的表达可能与妊娠丢失反复发作有一定关联，但这需要未来进一步研究证实。

综上所述，复发性EPL与叶酸代谢相关基因多态性具有相关性，对于有高危基因型突变的妊娠妇女应尽早、及时地进行干预，减少复发性EPL的发生。