HPLC法测定大花胡麻草不同部位中2种环烯醚萜苷成分含量

张传利 赵 秀 朱春梅 李维峰 马 晓 杜华波 何素明

云南农业大学热带作物学院，云南 普洱 665099

大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)又称红根野蚕豆、野蚕豆根[1]，是胡麻草属草本植物，与地黄、玄参等中药材同属于玄参科(Scrophulariaceae)[2-3]，始载于《中华本草》，在云南、广西、贵州等民间常将其根用于治疗闭经，痛经、崩漏、小儿高热、尿血、不孕症、跌打损伤、外伤出血及风湿骨痛[4]，在开发治疗心血管疾病、白血病、利尿、降压、降糖、保肝等方面新型药物及保健食品有很好的前景[5]。大花胡麻草根中含有杜鹃红素、甘露醇以及多种环烯醚萜苷类物质[6-7]，环烯醚萜苷类物质药用价值很高，是一类在自然界广泛分布的天然产物，具有消炎、抗癌、防衰老、抗氧化、降血糖、强心、免疫调节活性等多种药理活性[8]。大花胡麻草作为玄参科家族的一员，国内外对其研究较少，主要是集中在对大花胡麻草根的化学成分鉴定及部分成分的活性研究方面[1-3,7,9],而对根部以外的其他部位研究及各部位中的有效成分的含量研究还未见报道。基于此，本试验运用HPLC测定栽培大花胡麻草中2种环烯醚萜苷的含量，以期探讨梓醇和桃叶珊瑚苷在栽培大花胡麻草中的含量分布，为其药用部位选择、不同药物和保健食品开发提供参考。

1 试剂与仪器

1.1 试剂 大花胡麻草新鲜样品：采自于云南省红河州屏边县，经普洱市民族医药研究所张绍云主任药师鉴定为玄参科胡麻草属植物大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth.)的根、茎、叶、花；桃叶珊瑚苷(纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为A117980-25 mg)与梓醇(纯度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为 C110216-100 mg)对照品；乙腈(色谱纯，德国 MERCK)、甲醇(色谱纯，德国MERCK)、磷酸(分析纯)，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器 安捷伦1200高效液相仪(安捷伦科技有限公司)；SK5200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；CN61M/DZF真空干燥箱(上海奥豪斯贸易有限公司)、ME204E电子分析天平(上海奥豪斯贸易有限公司)；纯水/超纯水系统(韩国HUMAN PowerI)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称定桃叶珊瑚苷、梓醇对照品1.08 mg、1.23 mg，至10 mL棕色容量瓶中，加各自流动相定容，摇匀，制成0.108 mg/mL的桃叶珊瑚苷溶液和0.123 mg/mL的梓醇溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称量根、茎、叶、花等部位样品和混合样(根茎叶质量比1∶1∶1)粉末0.5 g置于具塞锥形瓶中，精密加入40%甲醇5 mL，摇匀并称定质量，超声处理(功率250 W，频率35 kHZ)30min，静置5 min，用40%甲醇补足减失的质量，吸取溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过[10]，即得。

2.3 HPLC测定桃叶珊瑚苷和梓醇分析条件 桃叶珊瑚苷、梓醇测定色谱柱分别为Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、SPHERI-5RP-18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相分别为乙晴-水(3∶97)、甲醇-0.1%磷酸水(1∶99)；检测波长分别为205 nm、210 nm；流速均为1 mL/min；进样量均为20 uL；柱温分别为25℃、35℃。桃叶珊瑚苷、梓醇HPLC色谱图见图1、2。结果表明，在此条件下，桃叶珊瑚苷保留时间约为 12.5 min，供试品溶液色谱图在对照品溶液保留时间处有相同色谱峰，且与相邻峰分离度符合要求。

2.4 线性关系考察 配制梓醇对照品溶液：0.0615、0.09225、0.123、0.15375、0.1845、0.5535、1.107 mg/mL；桃叶珊瑚苷对照品溶液：0.0036、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180、0.216 mg/mL。在“2.3”项色谱条件下进样，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线[11]，得桃叶珊瑚苷、梓醇回归方程分别为Y=16899435.76X+1357.21(r=0.9999)、Y=7097432.22X+3001.34(r=0.9999)。结果表明，分别在3.6～216.0 μg/mL、61.5～1107.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.1”对照品溶液20 μL，分别在“2.3”项色谱条件下，连续进样6次，测峰面积，计算各峰面积RSD。得梓醇、桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为0.67%、0.64%，表明仪器具有良好精密度。

2.6 重复性试验 取栽培大花胡麻草各部位和混合样粉末各6份，每份约0.5 g，精密称定，在“2.2”项下配制后依次进样，在“2.3”项下测定。得根、叶、花、混合样梓醇平均含量分别为0.1557、10.8382、1.851、0.7256 mg/g，梓醇含量的RSD分别为1.85、0.14、0.66、0.85%；得根、茎、叶、花、混合样桃叶珊瑚苷平均含量分别为0.9297、0.0398、0.3903、0.00382、0.3195 mg/g，叶珊瑚苷含量的RSD分别为0.73、1.02、0.66、1.97、0.94%。表明所建立方法具有良好的重复性。

2.7 稳定性试验 取栽培大花胡麻草根供试品，在“2.2”项下配置0、2、4、8、12、24 h后依次进样，分别考察梓醇和桃叶珊瑚苷的稳定性。得梓醇、桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为0.48%、0.74%，表明在24 h内供试品溶液稳定

2.8 加样回收率试验 精密称取6份同批样品粉末约0.25 g，同时精密加入梓醇对照品0.3 mL(0.123 mg/mL)、桃叶珊瑚苷对照品2.2 mL(0.108 mg/mL)，分别按“2.3”项色谱条件下测定。得梓醇、桃叶珊瑚苷平均回收率分别为99.87%、99.88%；RSD分别为0.61%、0.42%，具体结果见表1。

表1 梓醇和桃叶珊瑚苷加样回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品含量测定 取大花胡麻草各部位和混合样样品各约0.5 g，平行6份，按“2.2”项方法制备供试品溶液，在“2.3”项下测定，分别吸取各样品20 μL，计算各部位样品含量。具体结果和含量比较见表2、图3。

由表2和图3可知，在栽培大花胡麻草植株中，桃叶珊瑚苷在各部位均有分布，以根中最高，且与其他部位间存在显著差异；梓醇在根、叶、花等部位中有分布，在茎中未检出，以叶中最高，检出各部位间均存在显著差异。

表2 栽培大花胡麻草根、茎、叶、花中梓醇和桃叶珊瑚苷含量测定结果

注:数据后字母表示P<0.05水平的差异显著性;“-”表示未检测到该部位含量。

3 结论与讨论

大花胡麻草为环烯醚萜苷类化合物来源的一类天然产物资源，从表2和图3可知，梓醇和桃叶珊瑚苷在栽培大花胡麻草各部位中几乎均有分布，但不同部位间的含量却存在显著差异，2种环烯醚萜苷活性成分在植株内分布规律也不一致，梓醇在植物内的含量表现为：叶>花>混合样>根，栽培叶中含量高达10.838 mg/g，是其它部位的5.9～69.5倍，且叶中梓醇含量是药典规定最低含量的5.4倍以上；桃叶珊瑚苷在植物体内的含量表现为：根>叶>混合样>茎>花，栽培根中含量最高为0.930 mg/g，是其它部位的2.4～232.5倍。近从梓醇和桃叶珊瑚苷两种活性成分在栽培大花胡麻草植株内分布和含量分析结果可初步得出云南民间习惯以根入药和作为产品开发的部位从不同物质功效和治疗效果上在一定程度上是不合理的，且除根以外的其他部位可根据不同功效需求来开发不同的产品，是可以合理利用，如花中含量微量的桃叶珊瑚苷可以作为开发花茶的原料；另外，根、茎、叶按质量1∶1∶1的比例混合样中桃叶珊瑚苷和梓醇含量均适宜，适合用于开发复合功效产品的原料。

本实验只分析比较了来源同一产地的栽培大花胡麻草不同部位中梓醇和桃叶珊瑚苷的含量差异，但不同生态环境对生物活性成分的有效积累影响较大，其他产地和不同栽培条件下栽培大花胡麻草中梓醇和桃叶珊瑚苷的含量是否在植株内符合本实验的研究结果，需要进一步研究。

本研究测定并分析比较了栽培大花胡麻草中2种环烯醚萜苷的含量，得到了梓醇和桃叶珊瑚苷在栽培大花胡麻草植株内的含量和分布规律，并在参照《中国药典》(2015年版，一部)[12]中高效液相色谱法的基础上对提取溶剂、溶剂浓度和流动相分离比例进行筛选和优化，建立了分离效果较好的色谱条件，为今后有效测定栽培大花胡麻草中环烯醚萜苷类活性成分提高一定的科学依据，且在精密度、稳定性、重复性和回收率等指标方面均表现良好，也为今后该天然产物资源质量控制提供一定参考。