苦荞麦总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛素信号转导通路中GSK-3β、AKt相关基因与蛋白表达的影响

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种发病率极高的代谢性疾病，已严重影响人类生活。据国际糖尿病联盟(the International Diabetes Federation，IDF)发布的第八版全球糖尿病地图数据显示，2017年全球共有4.25亿糖尿病患者，其中中国患病人数最多[1]，90%～95%为2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)[2]。T2DM的病理机制与胰岛β细胞功能失常和胰岛素抵抗关系十分密切，其在环境、遗传等因素的影响下通常表现为胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)[3]。糖原合成激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是胰岛素受体信号转导通路中一个关键节点，它在细胞中过度表达会引起胰岛素信号转导受阻，引起IR[4-7]，有实验表明抑制GSK-3β活性可改善小鼠的糖耐量水平，使肝糖原代谢增加进而增加肝糖原含量[8]。在胰岛素信号转导通路中，激活的蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)可使GSK-3β磷酸化从而失活达到降血糖的目的。因此，促进Akt表达从而抑制GSK-3β可以减轻胰岛素抵抗，改善糖耐量水平，产生潜在的抗糖尿病效果[9]。

苦荞麦作为一种药食两用的植物，在国内外被广泛种植[10]。其黄酮类化合物在医药保健方面具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力及保护心脑血管等多种功效[11-12]。研究通过观察苦荞麦总黄酮对Ⅱ型糖尿病胰岛素信号转导通路中GSK-3β和Akt基因与蛋白的表达情况的影响，测定各组大鼠肝组织中mRNA与蛋白含量，探讨苦荞麦总黄酮对Ⅱ型糖尿病影响的作用与机制。

1 实验材料

1.1 动物与饲料 SPF级wistar大鼠78只，雄性，许可证号SCXK(辽)2015-0001 辽宁长生生物技术有限公司。高脂饲料和普通饲料(沈阳市于洪区前民动物实验饲料厂)；猪油和蔗糖(沈阳市和平区金味源食品批发部)。

1.2 药品与试剂 苦荞麦总黄酮(日本三益制药株式会社，含量为991.65 mg/g)；二甲双胍(批号：20150617，沈阳维康医药连锁有限公司)；链脲佐菌素(批号:1122F032，solarbio)；胰岛素ELISA试剂盒；氯仿、异丙醇、无水乙醇(20150607)国药集团化学试剂有限公司；RT-PCR试剂盒(AK5701)，核酸Marker(A801A)，上、下游引物(CHPA194)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(批号：20151222，Solarbio)；NC膜(批号：T426062，Pall)；TBS缓冲剂(批号：60900120)、蛋白ladder(批号：69J00157)购自北京鼎国公司；SDS-PAGE电泳粉(批号：20161111)、BCA蛋白含量检测试剂盒(批号：20160629)购自凯基生物；蛋白提取试剂盒(批号：20160622)，GSK-3β(批号：0003)、Akt(批号：0020)、GAPDH(批号：0010)均为CST公司；HRP标记抗兔二抗(批号：0026，CST公司)。

1.3 仪器 ACCU-CHEK血糖仪(罗氏诊断产品有限公司)；ACCU-CHEK血糖试纸(罗氏诊断产品有限公司)；iMark酶标仪(美国BD)；JD500-3电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；DW-HL388超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)；HR/T20M台式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；HE-90水平电泳槽、VE-180垂直电泳槽均为上海天能科技有限公司；S1000 Thermal Cycler梯度PCR仪(BIO-RAD)；Chemi XR5凝胶成像分析仪；化学发光仪。

2 方法

2.1 试剂配制

2.1.1 链脲佐菌素(STZ)注射液 将柠檬酸(2.585 g)、柠檬酸三钠(2.265 g)用150 mL三蒸水溶解，用HCL调pH至4.2后用三蒸水定容至200 mL，4℃储存。使用时加STZ配成浓度为2%STZ溶液，注意用滤膜除菌。

2.1.2 Western blot缓冲液的配制

2.1.2.1 TBS存储液 粉剂常温存放，使用时直接用纯水稀释成1 L的存储液。

2.1.2.2 TBST洗液 由1L TBS存储液加入0.5 mL吐温混匀制成。

2.1.2.3 转膜液 配转膜液由粉剂在配液时加热，并用纯水定容至800 mL，再加200 mL甲醇混匀而成。

2.1.2.4 封闭液 封闭液浓度为5%，即用5 g奶粉加100 mL纯水制成。

2.2 动物模型建立 雄性wistar大鼠于动物实验中心适应性喂养(猪油及蔗糖)3 d后，随机分为两组：对照组(普通饲料)7只，高脂饲料组(高脂饲料)71只(分笼饲养，每笼7只)，喂养8周。喂养8周后，高脂饲料组按体质量筛选出成为食源性肥胖的大鼠(标准：高脂饲料组个体质量≥对照组个体质量均值+2倍标准差)后，继续喂养4周。空腹状态下用氧化酶法测定各组大鼠血糖；同时眶静脉取血，用ELISA法检测胰岛素水平。计算胰岛素敏感指数(ISI)=1/(FINSxFBG)(FINS为空腹胰岛素，FPG为空腹血糖)。将对照组与高脂饲料组进行对照，筛选建立高脂饲料组大鼠胰岛素抵抗模型。建模后对高脂饲料组大鼠进行连续2周腹腔注射链脲佐菌素，剂量为25 mg/kg·周。再次测量空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L视为造糖尿病模型造模成功[13-14]。

2.3 动物分组 除对照组外，将糖尿病造模成功大鼠随机分5组，分别为模型组7只；4个用药组分别为苦荞麦总黄酮低剂量组7只(用药量50 mg/kg)；苦荞麦总黄酮中剂量组7只(用药量100 mg/kg)；苦荞麦总黄酮高剂量组7只(用药量200 mg/kg)；西药组7只(二甲双胍100 mg/kg)。灌胃给药4周后，再次眶静脉取血后处死各组大鼠，提取肝组织。

2.4 指标测定及方法 给予高脂饲料8周后测量大鼠体重;给予大鼠注射STZ前，用ELISA法和氧化酶法分别测量大鼠的胰岛素和血糖水平，并计算胰岛素抵抗指数。具体方法：准备96孔加样板，试剂盒室温平衡30 min后，将样品和标准品、生物素标记二抗和酶标试剂，置于37℃水浴中反应60 min；洗板5次，加入试剂盒中显色液A 50 μL和B 50 μL，37℃水浴中反应10 min；加入终止液50 μL后于10 min内放入酶标仪450 nm波长下读取OD值并计算;给予注射STZ 2周后用ELISA法测胰岛素水平和血糖水平，并计算胰岛素抵抗指数。方法同前。

2.4.1 RT-PCR法检测大鼠肝组织中GSK-3β、Akt的mRNA表达情况

2.4.1.1 分离RNA 于冰盘上取100 mg大鼠肝组织，用预冷生理盐水冲洗后剪碎，放入匀浆器内，加入1 mL Trizol试剂匀浆裂解细胞。静止5 min后，转移裂解液到EP管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈摇动混匀。4℃静置5 min后、12 000 rpm离心15 min。用移液器将水相转移到新管中，加入等体积异丙醇混匀，静置10 min。再次4℃、12 000 rpm离心10 min。去上清，加入1 mL 75%乙醇混匀，静置5 min。第3次4℃、1 2000 rpm离心5 min。分离出RNA，倒掉乙醇，静置5 min后加入30 μL DEPC水溶解，得到RNA溶液。取12 μL RNA溶液，加入 DEPC 水稀释，用酶标仪测定260 nm 和280 nm的吸光度，并计算RNA的浓度和纯度。

2.4.1.2 反转录出mRNA 按TAKARA试剂盒说明书要求配制10 μL反转录体系，于PCR仪中42～60℃条件下放置15～30 min，95℃条件下5 min，5℃条件下5 min；再配制PCR反应液40 μL，把此反应液加入到反转录反应结束的PCR反应管中，轻轻混匀，离心约10 s，进行PCR反应：94℃进行30sec，55～65℃进行30sec，上述两步骤重复30Cycles，然后72℃进行50sec。准备上样。在上述RT-PCR过程中用到的上、下游引物及合成序列长度如下：GSK-3β的上游引物序列为5′-TCGTCCATCGATGTGTGGTC-3′，下游引物序列为5′-TTGTCCAGGGGTGAGCTTTG-3′，合成长度为202bp，退火温度为60℃；Akt的上游引物序列为5′- AGAGAGCCGAGTCCTACAGAATA-3′，下游引物序列为5′-CCGAGAGAGGTGGAAAAACA-3′，合成长度为133bp，退火温度为61℃；GAPDH的上游引物序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，合成长度为500bp，退火温度为60℃。

2.4.1.3 凝胶成像 制备1.5%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中。取5 μL样本和1 μL上样缓冲液，混合成6 μL上样液。琼脂糖凝胶上样后接通电源，110 V，约1 h。放入凝胶成像系统拍照并分析条带。

2.4.2 Western-blot法测定大鼠肝组织中GSK-3β、AKT的蛋白表达情况

2.4.2.1 蛋白样品制备 取100 mg肝组织，于冰上在EP管内剪碎，加入裂解液，用超声破碎仪充分匀浆裂解。将匀浆裂解液在离心机中4℃、14 000 rpm离心10 min；将上清液转移至新的冰上预冷的1.5 mL EP管中，得到全蛋白提取物，可以进行蛋白定量。

2.4.2.2 BCA法测定蛋白含量 按说明书将蛋白样本稀释。试剂A：试剂B(50∶1)配制，计算样本浓度。使每孔上样蛋白量达40 μg，混匀后置沸水浴5 min。10 000 rpm转1 min后直接取上清液上蛋白样本。

2.4.2.3 电泳 配10%分离胶。配5%浓缩胶，胶液加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，然后将梳子水平插入，4℃静置2h。将其放入电泳槽中，分别加入样本和ladder。电泳时样本在浓缩胶时恒压80V，在分离胶时恒压120V。取胶，将胶放置在含有转膜液的托盘内。

2.4.2.4 转膜 在冰盆中湿转，1L湿转液。将夹子放入转膜槽中。恒压100V，78 min定时。

2.4.2.5 封闭 根据目的蛋白分子量将膜剪成细条放入封闭盒内，加5%的封闭液，放入水浴箱内，37℃，缓慢振荡1.5h。倒掉封闭液，TBST于摇床上洗3次，每次3 min。

2.4.2.6 抗体孵育与免疫反应 一抗滴加于膜上，室温下轻摇孵育1h后4℃静置过夜；膜用TBST洗3次，每次10 min于摇床上；加入稀释二抗后放于37℃水浴中1 h；TBST洗3次，每次10 min。

2.4.2.7 化学发光 将发光液试剂盒按比例于EP管中混匀，滴加于膜上，放入发光仪进行曝光并拍照。

3 结果

3.1 饲养8周后各组大鼠体重的变化 各高脂饲料组与对照组相比较，大鼠体重明显增加(P<0.05)，成功筛选出食源性肥胖大鼠。见表1。

组别体重/g对照组795.143±17.430 高脂饲料组1号笼960.000±36.240∗高脂饲料组2号笼969.000±38.314∗高脂饲料组3号笼949.571±44.806∗高脂饲料组4号笼957.286±35.288∗高脂饲料组5号笼966.000±38.803∗高脂饲料组6号笼974.857±45.378∗高脂饲料组7号笼957.143±36.821∗高脂饲料组8号笼962.571±35.298∗高脂饲料组9号笼954.286±36.931∗高脂饲料组10号笼944.586±61.424∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

3.2 饲养12周后各组大鼠胰岛素敏感指数的变化 各高脂饲料组与对照组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显下降(P<0.05)。见表2。

3.3 饲养12周后各组大鼠血液中胰岛素水平的变化 各组间经两两比较，血液中胰岛素水平差异无统计学意义(P<0.05)。见表3。

组别胰岛素敏感指数对照组0.0185±0.00614 高脂饲料组1号笼0.0101±0.00412∗高脂饲料组2号笼0.0097±0.00407∗高脂饲料组3号笼0.0125±0.00557∗高脂饲料组4号笼0.0121±0.00498∗高脂饲料组5号笼0.0117±0.00450∗高脂饲料组6号笼0.0112±0.00369∗高脂饲料组7号笼0.0109±0.00352∗高脂饲料组8号笼0.0105±0.00380∗高脂饲料组9号笼0.0103±0.00403∗高脂饲料组10号笼0.0101±0.00407∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别胰岛素水平/mIU/L对照组11.1024±2.39031 高脂饲料组1号笼12.1161±3.61210∗高脂饲料组2号笼11.5857±2.84413∗高脂饲料组3号笼11.3721±2.73974∗高脂饲料组4号笼11.3277±2.72098∗高脂饲料组5号笼11.0949±2.52838∗高脂饲料组6号笼11.0109±2.50263∗高脂饲料组7号笼10.7271±2.48023∗高脂饲料组8号笼10.5540±2.30558∗高脂饲料组9号笼10.5281±2.61187∗高脂饲料组10号笼10.1854±2.61922∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

3.4 给予药物干预后各组大鼠血糖水平的变化 模型组与对照组相比较，大鼠血糖水平明显提高(P<0.05)；苦荞麦总黄酮低、中、高剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠血糖水平明显下降(P<0.05)，其中苦荞麦中剂量组与西药组降血糖效果较好。见表4。

组别血糖水平/mmol/L对照组4.286±0.302模型组28.957±0.439∗苦荞麦总黄酮低剂量组19.343±0.458#苦荞麦总黄酮中剂量组5.929±0.431#苦荞麦总黄酮高剂量组8.857±0.355#西药组4.871±0.263#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.5 给予药物干预后各组大鼠血液中胰岛素水平的变化 模型组与对照组相比较，大鼠胰岛素水平明显下降(P<0.05)；苦荞麦总黄酮低、中剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠胰岛素水平明显提高(P<0.05)，其中苦荞麦中剂量组、西药组与对照组胰岛素水平相近。见表5。

组别胰岛素水平/mIU/L对照组11.809±1.300模型组9.108±0.775∗苦荞麦总黄酮低剂量组12.555±1.051#苦荞麦总黄酮中剂量组11.117±1.360#苦荞麦总黄酮高剂量组10.117±0.856西药组11.071±0.6712#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.6 给予药物干预后各组大鼠胰岛素敏感指数的变化 模型组与对照组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显下降(P<0.05)；苦荞麦总黄酮中、高剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显提高(P<0.05)，其中苦荞麦中剂量组与西药组大鼠胰岛素敏感指数与对照组相近。见表6。

组别胰岛素敏感指数对照组0.0200±0.00196模型组0.0038±0.00035∗苦荞麦总黄酮低剂量组0.0041±0.0004#苦荞麦总黄酮中剂量组0.0154±0.00133#苦荞麦总黄酮高剂量组0.0112±0.00074#西药组0.0186±0.00059#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.7 各组大鼠肝组织中GSK-3β mRNA的相对表达情况 与对照组相比较，模型组组织中GSK-3β mRNA的表达明显提高(P<0.05)；苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组和模型组相比较，GSK-3βmRNA的表达明显下降(P<0.05)。如图1所示，见表7。

3.8 各组大鼠肝组织中Akt mRNA的相对表达情况 与对照组相比较，模型组组织中Akt mRNA 的表达明显减少(P<0.05)；苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组和模型组相比较，Akt mRNA 的表达明显增加(P<0.05)。如图2所示，见表8。

组别GSK-3β与GAPDH mRNA表达光密度比值对照组0.1727±0.01469模型组0.9228±0.05824∗苦荞麦总黄酮中剂量组0.8230±0.05311#西药组0.5227±0.04111#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

组别Akt与GAPDH mRNA表达光密度比值对照组0.1567±0.01250模型组0.0631±0.00783∗苦荞麦总黄酮中剂量组0.1426±0.00948#西药组0.0858±0.00781#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05。

3.9 各组大鼠肝组织中GSK-3β蛋白的相对表达情况 模型组与对照组相比较，组织中GSK-3β蛋白的表达明显增加(P<0.05)；苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组与模型组相比较，GSK-3β蛋白的表达明显减少(P<0.05)。如图3所示，见表9。

组别GSK-3β与GAPDH 蛋白表达光密度比值对照组0.8125±0.03744模型组1.6740±0.09700∗苦荞麦总黄酮中剂量组1.2623±0.44680#西药组1.0719±0.45873#

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05。

3.10 各组大鼠肝组织中AKT蛋白的相对表达情况 模型组与对照组相比较，组织中AKT蛋白的表达减少有统计学差异(P<0.05)；苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组与模型组相比较，AKT蛋白的表达增加有统计学差异(P<0.05)。如图4所示，见表10。

组别AKT与GAPDH 蛋白表达光密度比值对照组0.8982±0.02700模型组0.1420±0.00350∗苦荞麦总黄酮中剂量组0.7582±0.02462#西药组0.4475±0.01009#

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

本实验结果表明，苦荞麦总黄酮低、中、高3个剂量组中，中剂量组效果最好。和模型组相比较，苦荞麦总黄酮中剂量组与西药组在控制T2DM大鼠血糖方面效果显著，可明显提高T2DM大鼠胰岛素水平，提高其胰岛素敏感指数。证明苦荞麦总黄酮对T2DM大鼠的病情有积极影响，其机制与苦荞麦总黄酮能使胰岛素转导通路中GSK-3βmRNA和蛋白表达减少、Akt mRNA和蛋白表达增加有关。

研究表明，多数T2DM患者存在IR[15]，降低IR是治疗T2DM的关键[16]，IR与胰岛素作用调节通路有关[17]。胰岛素信号转导通路中激活的Akt使 GSK-3β磷酸化而失活[18]，阻止GSK-3β对其底物糖原合成酶的磷酸化作用，糖原合成酶去磷酸化后恢复活性，发挥糖原合成作用，减少细胞中葡萄糖浓度。并且GSK-3β影响糖原合成酶活性不受胰岛素浓度影响[19]。同时有实验表明使用高选择性抑制剂抑制GSK-3β 活性可增加葡萄糖的转运从而提高胰岛素的活性[20]，减少IR，进而达到降血糖作用。

因此，可以肯定激活Akt基因与蛋白表达、抑制GSK-3β基因与蛋白表达对降低T2DM大鼠血糖水平，升高胰岛素敏感指数及改善胰岛素抵抗有一定效果。苦荞麦总黄酮通过影响胰岛素信号转导通路中GSK-3β与Akt两个基因与蛋白的表达影响T2DM大鼠。

本实验通过选择使用链脲佐菌素(STZ)选择性破坏动物胰岛β细胞从而导致糖尿病[21-22]，目前国内广泛采用高脂高糖饮食联合注射小剂量STZ建立T2DM模型，该模型具有高血糖、胰岛素抵抗等特点，与人类糖尿病发病过程和发病机理相似[23]。苦荞麦作为一种药食同源的植物，在改善T2DM的血糖水平，胰岛素抵抗方面，有一定的开发潜力。