IL-1β诱导椎间盘细胞凋亡通路再认识

韩敦富，尹荷珊，管晨彤，王 磐，张培国，王建秀

炎症因子特别是白介素(interleukin，IL)-1β不仅抑制椎间盘细胞合成细胞外基质，而且诱导基质金属蛋白酶分泌，导致细胞外基质减少[1-2]。研究发现，其对椎间盘细胞的凋亡作用不容忽视[3-6]，它不仅能够直接导致椎间盘细胞凋亡，且还可明显提高椎间盘细胞对Fas Ligand介导的凋亡敏感性[4]，促进椎间盘细胞凋亡。目前的研究认为，IL-1β通过线粒体损伤途径诱发椎间盘细胞凋亡[5-7]，膜受体途径是否参加该过程尚不清楚。

本研究采用IL-1β刺激正常大鼠椎间盘髓核细胞，并分别检测Fas/FasL凋亡途径中的关键因子Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA的表达水平，检测Caspase-8，9，3的酶活性和线粒体膜电势的改变，对椎间盘细胞凋亡途径进行再探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 3月龄SD大鼠共12只，雌雄不限，清洁级[中山大学动物实验中心，合格证号SCXK(粤)2015-0623]。

1.1.2试剂及仪器 DMEM-F12培养基(批号：1501133，美国Gibco公司)；特优级胎牛血清(批号：1407236，美国Hyclone公司)；重组大鼠IL-1β(批号：1501268，美国R&D Systems公司)；RT-PCR试剂盒(批号：1409225，日本TaKaRa公司)；PCR引物(批号：1506167，中国上海生工生物工程公司)；碘化丙啶、Annexin V-FITC(批号：1503157，奥地利Bender MedSystems公司)；Caspase-8，9，3 CoLorimetric Activity Assay Kit(批号：1503218，加拿大Chemicon公司)；线粒体膜电势检测试剂盒(批号：1501268，美国R&D Systems公司)。流式细胞仪(美国Beckman CouLter公司)；酶标仪(WeLLscan MK3，芬兰Thermo Labsystems公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠椎间盘髓核细胞分离和培养 参照文献[8]方法，10%水合氯醛麻醉SD大鼠，取出L3～L6椎间盘髓核组织，PBS缓冲液冲洗、切碎、转移、胰蛋白酶消化、过滤、离心，以1×106mL-1密度在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，鉴定。

1.2.2细胞准备 原代细胞融合达85%～90%时，以3×105细胞/孔接种于6孔板中。10%FBS培养基，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养至细胞融合达80%以上时，更换为1%FBS培养基，培养条件度不变，培养8 h。

1.2.3分组 建立A，B，C及D共4组：A组为空白对照组；B，C及D组分别加入10，20，50 ng/mL浓度的IL-1β后再培养24 h。

1.2.4检测细胞凋亡 以上4组在培养24 h后更换为1%FBS培养基，倒置显微镜观察细胞凋亡情况。胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，离心收集全部细胞，EpicsALtra流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.5凋亡途径相关因子检测 细胞与IL-1β共培养24 h后，分别检测Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA的表达水平，检测Caspase-8，9，3酶活性变化及线粒体膜电势的改变情况。

1.2.5.1Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA表达水平检测 TRIzoL法提取总RNA，两步法RT-PCR进行扩增(表1)，收集PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行拍照，图像分析软件进行光密度扫描分析。

表1Fas，Caspase，β-actin上下游引物序列、退火温度及产物长度

Tab 1Primer sequence, annealing temperature and product length of Fas,Caspase,β-actin

1.2.5.2Caspase-8，9，3酶活性变化测定 酶活性检测基于pNA标记底物的比色法，分别按照酶活试剂盒标准步骤进行。髓核细胞与IL-1β共培养24 h后，胰酶消化收集全部细胞，在酶标仪上405 nm波长读出OD值和作出标准曲线，据此计算出Caspase-8，9，3酶活性变化情况。

1.2.5.3线粒体膜电势改变情况检测 胰酶消化收集全部细胞，按线粒体膜电势试剂盒检测标准步骤完成后，即刻在荧光显微镜下观察拍照，立即用流式细胞仪分析线粒体电势变化。

2 结 果

2.1不同浓度IL-1β对髓核细胞的凋亡作用 倒置显微镜观察：髓核细胞和IL-1β共培养24 h后，随着IL-1β浓度增加，发生形态改变的细胞也明显增加，伪足回缩，细胞折光变化，有絮状细胞器释放，凋亡细胞漂浮增多(图1)。流式细胞仪分析细胞凋亡结果与镜下观察结果一致。

2.2细胞Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA的表达变化 RT-PCR检测结果显示：Fas，Caspase-9和Caspase-3 mRNA的表达与IL-1β浓度呈正相关，较大浓度的IL-1β(50 ng/mL)对髓核细胞Fas mRNA的上调作用更明显；与之不同，10，20 ng/mL的IL-1β对Caspase-8及Bid mRNA影响无统计学意义，而50 ng/mL IL-1β则明显上调Caspase-8及Bid mRNA的表达(图2，3)。

A：空白对照组； B，C，D：10，20，50 ng/mL IL-1β组.

图2 髓核细胞与不同浓度IL-1β共培养24 h Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA表达变化情况

2.3Caspase-8，9，3酶活性检测 Caspase-8，9，3酶活性检测结果显示：IL-1β可以明显激活髓核细胞Caspase-9，3的酶活性，二者间酶活性存在一定的一致性，且具有较明显的 IL-1β浓度相关性；10，20 ng/mL的IL-1β对Caspase-8酶活性影响不明显，而50 ng/mL浓度的IL-1β则明显激活Caspase-8酶活性(表2)，该结果与RT-PCR结果一致。

2.4线粒体膜电势检测结果

2.4.1荧光显微镜下细胞线粒体膜电势改变 荧光显微镜下，线粒体膜电势发生改变的细胞胞浆呈现完全绿色，而健康细胞胞浆呈现红色。随着IL-1β浓度增加，呈现绿色的细胞明显增多，绿色越深表明线粒体膜电势变化越大(图4)。

图3 髓核细胞与不同浓度IL-1β共培养24 h Fas，Caspase-8，9，3及Bid mRNA表达变化比较

表2不同浓度IL-1β髓核细胞共培养24 h对各Caspase酶活性的影响

Tab 2Influence of co-culture of IL-1 beta myeloid cells at different concentrations for 24 h on the activity of Caspase enzymes

ρIL-1β/(ng·mL-1)酶活性Caspase-8Caspase-9Caspase-300.95±0.181.08±0.260.99±0.23100.95±0.152.05±0.22△2.29±0.24△201.34±0.234.22±0.30▲5.28±0.41▲503.28±0.47▲5.35±0.46▲7.34±0.58▲

Caspase：半胱氨酸蛋白酶. 与对照组比较，△：P<0.05，▲：P<0.01.

2.4.2流式细胞仪检测线粒体膜电势变化 右上象限为健康细胞，右下象限为线粒体膜电势发生变化细胞。可见细胞线粒体膜电势的改变随IL-1β浓度升高而明显升高，0，10，20，50 ng/mL的线粒体膜电势分别为(0.52±0.08)，(4.01±0.30)，(8.19±1.13)及(16.61±1.33)，差别具有统计学意义(P<0.05,图5)。

3 讨 论

椎间盘退变是一个复杂的过程。早有证据表明，椎间盘细胞的大量凋亡打断了椎间盘内部自我平衡机制，加速了退变进程[7-10]。目前认为细胞凋亡主要有3条途径，即死亡受体活化途径(膜受体途径)、线粒体损伤途径和内质网应激途径。3条途径并非截然分开。Fas/FasL凋亡系统是椎间盘细胞凋亡的主要途径，以Caspase-8激活为启动标志的膜受体途径和以Caspase-9激活为标志的线粒体损伤途径是该系统中的两条经典途径[8-13]。然而，椎间盘细胞凋亡的确切途径仍有不同研究结果[13]。Park等研究认为，椎间盘细胞的凋亡是通过膜受体途径进行的[10-11，14]。Park等在研究体外培养的兔椎间盘纤维环细胞凋亡时发现，膜受体途径中的Caspase-8,3被激活，而线粒体损伤途径中的细胞色素C的水平没有变化，并且阻断Caspase-8能够阻断凋亡，而阻断Caspase-9却对凋亡没有影响，因此认为线粒体损伤途径并未参与椎间盘细胞凋亡过程[15]。Rannou的研究则与上述结果完全相反，他们发现不论人还是兔的退变椎间盘标本均未检测到FasL阳性细胞，而检测到细胞色素C的表达；在体外培养的兔椎间盘纤维环细胞凋亡中检测到Caspase-9活性增强，而Caspase-8没有变化；阻断Caspase-9能够减少细胞凋亡，而阻断Caspase-8却对凋亡没有影响。因此，其认为线粒体损伤途径是椎间盘细胞凋亡途径，而膜受体途径并未参与[16]。Heyde的研究则发现，膜受体途径和线粒体损伤途径都参与椎间盘细胞的凋亡[17]。通过FasL对大鼠椎间盘细胞凋亡作用的研究发现，这两条经典途径均参与了椎间盘细胞的凋亡[9]。

图4 髓核细胞与不同浓度IL-1β共培养24 h荧光显微镜观察细胞线粒体膜电势的变化( ×100)

自Gronb等发现突出椎间盘组织中含有大量IL-1β等炎性因子表达以来，IL-1β对椎间盘细胞的凋亡作用越来越被重视[5-7]。研究认为，IL-1β可以直接通过线粒体途径发挥细胞凋亡作用。Shen等研究发现，IL-1β 可以诱发人退变椎间盘髓核细胞的凋亡和细胞自噬，检测到Bax和细胞色素C升高，导致线粒体损伤诱发人退变椎间盘髓核细胞的凋亡，用3-甲基腺嘌呤阻断线粒体途径可以减少细胞凋亡和自噬作用[7]。Niu等研究表明，高压氧可以降低Caspase-3，9，而不是Caspase-8的活性，从而减少人退变椎间盘髓核细胞的凋亡[18]。Hu等研究证实，通过阻断NF-κB信号通路和线粒体途径可以减轻大鼠椎间盘纤维环细胞的炎症反应和凋亡[6]。Yang等研究表明，IL-1β可以导致椎间盘纤维环细胞凋亡，同时Bax及Caspase-3，9表达升高[5]。以上研究均支持IL-1β通过线粒体损伤途径诱发椎间盘细胞凋亡。然而，Park等研究认为，椎间盘细胞的凋亡仅通过膜受体途径进行，线粒体损伤途径并未参与这一过程[10,11,14-15]。

图5 髓核细胞与不同浓度IL-1β共培养24 h流式细胞仪分析线粒体膜电势变化情况

本研究结果表明，IL-1β所诱导的椎间盘细胞凋亡率和Caspase-9，3 mRNA的表达、酶活性以及线粒体膜电势的改变均呈正相关关系，该结果与当前众多研究一致，说明线粒体损伤途径直接参与椎间盘细胞凋亡过程。本研究中，10，20 ng/mL的IL-1β对Caspase-8及Bid mRNA表达没有明显影响，而较高浓度(50 ng/mL)的IL-1β则明显上调了髓核细胞Caspase-8及Bid mRNA的表达，与此对应的死亡受体Fas的表达也明显上调，同时Caspase-8的活性也明显增强。这一现象表明，当IL-1β达到一定浓度时，激活了以Caspase-8激活为启动标志的膜受体途径。因此，本研究结果说明，IL-1β主要通过线粒体损伤途径诱导椎间盘细胞凋亡，高浓度时可以激活膜受体途径。

细胞凋亡是一个复杂的过程，启动凋亡因素的不同可能会导致凋亡途径的差异，不同的凋亡途径之间也会相互交叉相互影响。膜受体途径和线粒体损伤途径之间可以通过Bid作为桥梁产生交联，Bid通过抑制线粒体外膜上Bcl-2的功能影响线粒体膜的通透性而导致线粒体中的细胞色素C逸出，细胞色素C在胞质中激活Caspases-9，从而引发Caspase蛋白家族的级联反应，最终导致细胞凋亡。然而，Bid的功能发挥依赖于Caspase-8的激活，即在Fas/FasL凋亡系统中只能由Caspase-8通过激活Bid而激活线粒体损伤途径，反之则不然。那么，IL-1β是通过何种机制激活了细胞膜受体途径？笔者认为，这一作用极有可能是通过上调Fas的表达而进行的。以往研究结果显示，IL-1β不仅能够上调椎间盘细胞Fas的表达[8]，而且可提高其对FasL的应答敏感性[4]，从而产生超常凋亡。但是，对于IL-1β是如何上调Fas的表达还有待于进一步的研究。