钩吻素子对大鼠神经病理性痛行为学和脊髓机制研究

金桂林，何赛娣，岳荣彩，许 盈，叶丽香，俞昌喜

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是临床常见的慢性疼痛，其发病机制复杂，治疗困难，常伴有睡眠障碍、焦虑、抑郁等神经精神疾病，严重影响患者的工作和生活质量[1]。目前临床治疗NP的常用药物有抗癫痫药、抗抑郁药及阿片类镇痛药等，但因其治疗作用有限或毒副作用较大而不能让人满意，因此新型抗NP药物亟待研发。

钩吻素子为胡蔓藤科植物钩吻(GelsemiumelegansBenth)中含量较高的一种吲哚类生物碱[2]。本课题组前期研究发现，钩吻素子具有较好的抗炎和镇痛作用，且具有高效低毒的特征，具有创制新型镇痛药的潜能，但其作用机制尚不清楚[3-5]。本研究选用大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury, SNI)所引起的NP模型，进一步明确钩吻素子的抗NP作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 体质量为200～250 g的雄性SD大鼠[由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号: SCXK(沪)2009-0005]。实验操作经动物伦理委员会批准并遵循国际和本地相关条例。

1.1.2试剂 钩吻素子盐酸盐(由本课题组从国产钩吻中分离纯化，实验室批号KM201309，纯度99%以上)；加巴喷丁(上海信合化工有限公司)，纯度99%；水合氯醛。

1.1.3仪器 机械测痛仪(Dynamic Plantar Aesthesiometer 37450型，意大利UGO Basile公司)；酶标仪(Epoch，美国BioTek公司)；免疫印迹成像系统(Carastream公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠机械痛阈值测定 参照文献[6]的方法，使用测痛仪测定大鼠的机械痛阈值。待大鼠适应环境30 min后，用刺激丝垂直刺激大鼠后足测痛点。仪器加压速度为2 g/s，持续时间25 s，最大刺激强度为50 g。按开始键，仪器自动记录机械刺激力度数值。两次测量间隔不少于5 min，每只动物测量3次，取平均值。

1.2.2大鼠SNI诱导NP模型的制备及给药 大鼠SNI模型的建立方法参照文献[7]。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，消毒处理后依次暴露，并分离左侧后肢肱二头肌、坐骨神经主干、胫神经、腓总神经及腓肠神经，丝线结扎胫神经和腓总神经，并切断靠近结扎的远侧端。假手术组仅作暴露神经处理。术后大鼠逐层缝合，注射青霉素预防感染。模型成功判断标准：基础痛阈合格的动物，于SNI手术后第3天，术侧痛阈值低于非术侧65%，认定为SNI模型合格动物；术侧痛阈值高于非术侧痛阈值65%的动物不用于该实验。SNI合格及假手术大鼠，随机分为假手术组、模型组、钩吻素子低剂量及高剂量组(0.6和3.0 mg/kg)以及加巴喷丁对照组(800 mg/kg)，连续给药7 d后，测机械痛阈值。

1.2.3Western-blot法测定胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) 大鼠测痛结束后，取L4～L6的脊髓组织置于1 mL匀浆器中匀浆。裂解液裂解后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。转膜结束后，取出PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1～2 h；加入一抗4 ℃孵育过夜：小鼠抗GAPDH(1∶5 000)、兔抗GFAP(1∶1 000)、兔抗LC3B(1∶1 000)、兔抗Beclin 1(1∶1 000)、兔抗p62(1∶1 000)。弃去一抗，TBST清洗10 min×3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1～2 h：山羊抗小鼠(1∶5 000)、山羊抗兔(1∶5 000)；TBST清洗10 min×3次。用超敏ECL发光试剂盒显影，显影时间为1～5 min。GAPDH作为内参，采用Image J对条带进行吸光度的分析。

2 结 果

2.1钩吻素子对SNI大鼠的镇痛作用 假手术组术侧和对侧痛阈值差别无统计学意义(P=0.982)；SNI手术组术侧痛阈值显著低于对侧(P<0.01)，且显著低于假手术组术侧(P<0.001)；SNI大鼠和假手术大鼠对侧痛阈值差别无统计学意义(P>0.05，图1)。各给药组大鼠痛阈值变化如图2所示，SNI模型组大鼠痛阈值显著低于假手术组(P<0.001)；与SNI模型组比较，钩吻素子(3.0 mg/kg)组和加巴喷丁(800 mg/kg)组显著降低机械痛阈值，差别具有统计学意义(P<0.001和P<0.05)，但此两组对SNI大鼠的镇痛效应差别却无统计学意义(图2)。

2.2钩吻素子对SNI大鼠脊髓星形胶质细胞活化的作用 与假手术组比较，模型组的GFAP水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，钩吻素子可显著降低GFAP水平(P<0.01)。钩吻素子高、低剂量组对GFAP的影响差别有统计学意义(P<0.05，图3)。将各组大鼠最后一次的痛阈值与GFAP水平作相关性分析，显示二者呈中度负相关，相关系数为-0.717(P<0.01)。

SNI：分支选择性损伤. 与假手术组术侧比较，##：P<0.01，###：P<0.001；与SNI模型组对侧比较，☆☆：P<0.01；☆☆☆：P<0.001．

SNI：分支选择性损伤. 与假手术组比较，###：P<0.001；与SNI模型组比较，☆：P<0.05；☆☆：P<0.01．

2.3钩吻素子对SNI大鼠脊髓自噬水平的影响 SNI大鼠脊髓LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比正常大鼠高，钩吻素子可以显著增加LC3-Ⅱ在脊髓水平。SNI大鼠脊髓Beclin 1蛋白表达和正常大鼠比较差别无统计学意义，钩吻素子对Beclin 1在脊髓水平的表达无影响。SNI大鼠脊髓p62蛋白表达和正常大鼠比较差别无统计学意义，低剂量钩吻素子对p62在脊髓水平的表达影响较小(P>0.05)，高剂量钩吻素子对SNI大鼠脊髓水平p62的表达和正常大鼠比较差别有统计学意义(P<0.05，图4～5)。

SNI：分支选择性损伤；GFAP：胶质纤维酸性蛋白. A：各组大鼠脊髓GFAP蛋白表达水平；B：各组大鼠脊髓GFAP蛋白吸光度值. 与假手术组比较，#：P<0.01；与SNI模型组比较，☆：P<0.01．

图4 钩吻素子对SNI诱导神经病理性疼痛鼠脊髓自噬相关蛋白表达的影响

3 讨 论

NP是一种严重影响人类身心健康的疾病，其生理和病理机制极其复杂，目前尚不完全清楚。近年来，大量证据提示，胶质细胞介导的神经炎症反应在NP的发生发展过程中起着关键作用[8-10]。神经胶质细胞，主要为小胶质细胞和星形胶质细胞在NP过程中迅速活化，释放大量致炎细胞因子和趋化因子等物质，并加重神经元和胶质细胞的活化，造成多种神经细胞形成正反馈调节网络，进一步加重疼痛[11]。因此，抑制胶质细胞活化，减少中枢炎症水平，可显著抑制NP。

A：LC3； B：Beclin 1； C：p62. 与假手术组比较，##：P<0.01；与SNI模型组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001.

本研究在SNI诱导的大鼠NP模型上，观察到灌胃给予的钩吻素子可呈剂量和时间依赖性地对抗SNI大鼠机械超敏作用，且钩吻素子3.0 mg/kg组和加巴喷丁800 mg/kg组对SNI大鼠的痛敏改善作用相当。本实验选取加巴喷丁为阳性对照药，加巴喷丁为抗惊厥药物，主要作用于神经细胞膜表面钙离子通道，可减少谷氨酸、去甲肾上腺素及p物质等的释放，可缓解疼痛。但在本实验中，加巴喷丁对SNI诱导的NP镇痛作用剂量较大，这也提示钩吻素子有较好的抗NP作用。在连续给药过程中，钩吻素子无耐受现象，且可能有药效累加效应。相对于阿片类镇痛药，钩吻素子无身体依赖性和精神依赖性，这也是其作为镇痛药的一个优点[12]。除此之外，本课题组前期研究发现，钩吻素子还具有抗焦虑作用[13]，可缓解NP患者的紧张焦虑情绪。这都为钩吻素子作为抗慢性疼痛新药开发提供有利条件。

鉴于较好的镇痛作用，从钩吻素子抑制星形胶质细胞的活化来探讨其镇痛作用机制，发现钩吻素子抑制星形胶质细胞活化与其抗慢性疼痛的作用呈相关性。因GFAP是星形胶质细胞的骨架蛋白，也是星形胶质细胞活化的标志物。因此，本实验通过Western-blot测定脊髓中的GFAP水平来观察脊髓星形胶质细胞的活化情况，同时以大鼠脊髓自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin 1及p62表达水平为指标，观察在SNI疼痛模型中自噬水平的变化以及不同浓度钩吻素子对SNI大鼠在脊髓水平自噬的影响。小胶质细胞活化主要发生在NP发生的初始阶段，而星形胶质细胞与慢性疼痛的持续关系密切[14]。文献报道，星形胶质细胞活化抑制剂氟代柠檬酸可显著减轻NP[15]，提示抑制星形胶质细胞活化是治疗NP的研究方向。星形胶质细胞作为中枢数量最庞大的细胞，是致炎细胞因子的主要来源之一。星形胶质细胞的激活在多种慢性疼痛模型上都被证实，表现为细胞数量增加，GFAP表达增加[16-17]。通过注射GFAP反义核苷酸妨碍GFAP转录，或通过注射星形胶质细胞活化抑制剂都可改善外周神经损伤引起的NP[18]。本研究发现，钩吻素子可显著降低SNI大鼠的GFAP水平，提示星形胶质细胞可能是钩吻素子镇痛作用的靶细胞。同时，本研究探索了钩吻素子对SNI大鼠脊髓的自噬水平。自噬是细胞吞噬自身细胞质蛋白或降解细胞器实现自我更新的过程，也是细胞自我保护机制[19]。研究表明，自噬对NP的发生、发展等都有重要作用。在NP过程中脊髓自噬水平显著降低。反之，通过药理学手段促进自噬可显著减轻NP程度，也可延缓NP的发生[20-21]。本研究通过检测大鼠脊髓自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin 1及p62，发现SNI大鼠脊髓自噬水平出现抑制，与文献报道一致[22]。自噬进程受阻可导致细胞底物降解不完全，引起大分子及细胞器的堆积，进而导致NP的加重。而给予钩吻素子后，脊髓LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表达显著降低，提示钩吻素子可以上调NP脊髓自噬。NP大鼠脊髓自噬可发生在神经元和星形胶质细胞[22]。然而，钩吻素子发挥抗NP作用与其促进星形胶质细胞自噬及抑制星形胶质细胞活化的关系，还需进一步研究。

综上所述，钩吻素子可显著缓解SNI诱导的NP，同时上调SNI大鼠脊髓的自噬水平，抑制脊髓星形胶质细胞活化。该研究为钩吻素子作为抗慢性疼痛药物的研发提供了一定的依据。