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异丙肾上腺素对心肌缺血大鼠氧化应激反应及caspase-9的影响

2019-10-14韩芬杨晓

中国老年学杂志 2019年19期
关键词:氧化应激心肌细胞

韩芬 杨晓

(1郑州铁路职业技术学院药学院(基础医学部),河南 郑州 451460;2河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科)

目前,急性冠脉综合征患病率大大增加,已被看作是冠心病主要的致死原因之一〔1〕。冠状动脉血管旁路移植术、冠状动脉介入治疗、溶解血栓等均是挽救缺血心肌的主要再灌注方式〔2〕。然而尽管上述方法治疗效果尚佳,但心肌再灌注损伤仍是限制各治疗方法深入推行的阻碍,可见如何避免或减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤对改善患者预后尤为关键〔3〕。既往研究证实,β肾上腺素能受体(β-AR)参与了心电生理、心脏血液供应等生命活动,并在这些进程中发挥着至关重要的作用〔4,5〕。β1-肾上腺素受体(AR)、β2-AR均参与了心脏功能活动,在正常的生理情况下,β1-AR主要介导交感神经激动,而β2-AR则参与了心力衰竭等病理条件下的心功能调节〔6〕。本研究旨在观察异丙肾上腺素(ISO)对心肌缺血大鼠氧化应激反应与心肌凋亡的影响,以期为急性冠脉综合征再灌注预处理提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 成年雄性SD大鼠40只,平均体重(227.47±19.25)g,均来自中国食品药品检定研究院。

1.1.2实验仪器 DH-140动物呼吸机:泰盟科技有限公司;RM-6280型多导生理记录分析系统:成都市仪器公司;光学显微镜:日本奥林普斯公司;电热恒温培养箱:上海圣科公司;石蜡包埋机:武汉天之瑞公司;分光光度计:上海谱元公司;酶标仪:芬兰雷勃公司;电泳仪:BIO-RAD;数字病理扫描系统:美国Aperio公司;全自动化学发光分析仪。

1.1.3实验试剂 ISO:美国Sigma公司;ICI118551:美国Sigma公司;20%乌拉坦:武汉博士德公司;苏木素-伊红:碧云天研究所;β-actin抗体、磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)单克隆抗体:美国abcam公司;原位末端标记试剂:美国Roche公司;羊抗兔二抗:Bioswamp公司;caspase-9免疫组化试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒:碧云天研究所;丙二醛(MDA)试剂盒:上海酶联生物公司;磷酸缓冲液(PBS):联科生物公司。

1.2方法

1.2.1大鼠模型建立 将选中的40只大鼠称重,向其腹腔内注射5 mg/kg 20%乌拉坦麻醉。麻醉后取仰卧位使用胶布将其固定于工作台上,密切监测动物心电图机与呼吸机是否在正常状态下,选择实验需要的相关器材,开始模型建立。方法如下:使用针型电极放置于大鼠四肢皮下,密切观察监护仪并分析其心电图,心电图通常选择Ⅱ导联。对手术视野使用碘伏棉签消毒,颈正中切开气管行气管插管,与呼吸机连接,大鼠麻醉呼吸比1∶2,根据每公斤体重提供7 ml的比值设定潮气总量,设置呼吸频率为80次/min。沿着大鼠胸骨左缘3~4肋间依次将皮肤、皮下脂肪、肌层分离,待心脏显露后使用棉签将心包轻轻分离并将左心耳部分掀起,小心结扎左冠状动脉前降支(LAD),使用套管将血管夹闭,30 min后将套管松开完成120 min灌流,I/R模型建立成功后,结扎血管。血管成功结扎标准:LAD供血区心肌呈灰暗状,心电图ST-T段抬高,放松后ST-T段回落≥50%。

1.2.2实验模型分组 根据随机数表法分为假手术(Sham)组、I/R组、ISO组及β2-AR拮抗剂(ICI)组,每组10只。

1.2.3大鼠模型处理方法 Sham组大鼠在LAD处仅穿线但不结扎,麻醉时间为150 min;I/R组大鼠先将LAD结扎30 min,然后放松灌注缺血心肌120 min;ISO组:先使用ISO 10 mg/kg腹腔内注射,60 min后制备心肌I/R损伤模型;ICI组:使用ICI118551腹腔注射,剂量为0.5 mg/kg,注射30 min后使用ISO腹腔内注射,剂量为10 mg/kg,注射60 min后再制备大鼠I/R模型。为了便于平衡对照,需要为Sham组、I/R组SD大鼠适量生理盐水腹腔内注射。

1.3观察指标 (1)心肌组织病理形态:取大鼠心肌梗死部分组织,石蜡包埋切片后染色,利用光学显微镜400倍观察各组大鼠心肌组织形态;(2)P-Akt蛋白表达:使用剪刀截取心肌缺血区域组织并制备心肌碎片,裂解后离心,取上清液封存待检。经蛋白定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备、上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显色等方法步骤,利用化学发光法检测。(3)心肌凋亡检测:采用TUNEL法,将缺血心肌组织置于10%甲醛中充分固定24 h,脱水石蜡包埋,经400倍光学显微镜观察,若观察到棕色细胞核则确认为凋亡细胞,若细胞核为蓝色则属于非凋亡细胞,凋亡指数=细胞凋亡数/总细胞数×100%。(4)caspase-9蛋白表达:将大鼠灌注心肌经10%甲醛浸泡固定48 h后脱水、组织包埋、切片制作,置于载玻片上待检。于载玻片上加入单克隆抗体,过夜,冲洗2次,向内加入山羊血清稀释,室温下反应2 h,将多余液体甩去,PBS冲洗玻片,吸水纸将周围残余液体吸除,根据需要向内加入链霉卵白素,标记在室温下孵化,清洗后制备二氨基联苯胺(DAB)溶液,室温下显色;再次经苏木素浸泡20 s,自来水冲洗。干燥后镜下观察细胞质内caspase-9凋亡细胞,经数字病理扫描系统分析灰度值,灰度值与caspase-9表达呈负相关。(5)血清氧化应激反应:再灌注120 min后经腹主动脉抽取动脉血0.5 ml,离心后取上清液,使用氧化酶法检测SOD表达,使用巴比妥酸法检测MDA表达。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0软件,计量资料用t检验,4组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1心肌组织病理形态 Sham组心肌纤维结构清晰、整齐排列,胞质无水肿,间质正常;I/R组心肌纤维发生变性、中断,可见细胞间质水肿;ISO组可见心肌纤维变性、排列紊乱,但程度较I/R组相对轻微,间质情况好;ICI组心肌纤维较ISO组变性严重且错乱排列,有大量核溶解与破裂,间质明显加宽,有大量炎性细胞侵入。见图1。

图1 各组心肌形态学病理改变(×400)

2.2心肌组织P-Akt表达 I/R组心肌P-Akt蛋白表达(0.57±0.11)较Sham组(0.25±0.03)明显升高,ISO组心肌P-Akt蛋白表达(1.20±0.18)较I/R组明显升高,ICI组心肌P-Akt表达(0.36±0.09)较ISO组明显降低(均P<0.05)。

2.3心肌细胞凋亡比较 与Sham组〔(23.01±4.25)%〕比较,I/R组心肌细胞凋亡比例〔(40.12±6.45)%〕显著升高;与I/R组比较,ISO组凋亡比例〔(28.41±8.11)%〕明显降低;ICI组凋亡比例〔(41.57±8.24)%〕较ISO组明显升高;组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.4氧化应激反应指标比较 I/R组血清SOD水平较Sham组明显降低,MDA表达较Sham组明显升高;ISO组血清SOD表达较I/R组水平升高,MDA表达明显降低;ICI组血清SOD表达较ISO组明显降低,MDA表达明显升高;组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.5caspase-9表达 与Sham组比较,I/R组心肌纤维内caspase-9呈高表达;与I/R组比较,ISO组心肌纤维内caspase-9呈低表达;与ISO组比较,ICI组心肌纤维内caspase-9呈高表达;组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 4组SOD、MDA、caspase-9表达水平比较

与Sham组比较:1)P<0.05;与I/R组比较:2)P<0.05;与ISO组比较:3)P<0.05

3 讨 论

研究发现,使用ISO 10 mg/kg经腹腔注射预处理的方式能很好地对抗大鼠心肌I/R损伤〔7〕。Tong等〔8〕在2005年的大鼠离体试验中发现,经ISO 10 mmol/L缺血预处理后具有一定心脏保护之效,对缩小心肌梗死面积有一定价值。但Tang等〔9〕在2011年的研究中发现,将2.5 mg/kg ISO持续皮下注射7 d 后,药物能通过上调Cx43蛋白表达、氧化应激等机制增加心肌肥厚风险,加重心肌I/R损伤程度。

本研究中ISO组大鼠心肌组织形态规整性更好,氧化应激相关指标表达更理想,且心肌细胞凋亡比例更低,提示激活β2-AR能够帮助I/R心肌获益。既往与心肌I/R损伤及β-AR有关的实验研究指出,激活β-AR会损伤心肌,但也可能保护心肌〔10~12〕。β1-AR将对蛋白激酶A产生激活之效,抑制细胞色素-C氧化酶活性,加重再灌注梗死程度;而β2-AR则主要通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)途径对抗心肌I/R损伤〔13,14〕,这些论述均与本研究结果近乎一致。

本次研究结果提示ISO可能通过激活心肌I/R损伤大鼠PI3K-Akt通路对心肌凋亡产生抑制,进而对心肌I/R损伤产生保护作用,该机制与最新研究中提出的大鼠心肌I/R经药物预处理后起到的心肌保护作用类似〔15〕。在心肌I/R损伤挽救酶信号系统中,PI3K-Akt通路是最关键的信号通路之一,故调节细胞的凋亡过程是该信号通路最显著且关键的作用之一〔16〕。caspase家族是PI3K-Akt信号通路下游细胞凋亡家族,被看作是凋亡信号传导主要途径,属于天冬氨酸特异性水解酶,富含半胱氨酸〔17,18〕。caspase-9是该家族中主要的细胞凋亡执行因子,能够在其他相关细胞调解下,对核内核酸酶直接激活,导致细胞蛋白质、DNA裂解,触发甚至增加细胞凋亡〔19〕。近年来,氧化应激损伤逐渐被认为是心肌I/R损伤发生、发展的关键环节,SOD是抑制氧自由基损伤的重要屏障,能够对还原氧自由基产生催化之效,合成H2O2,在受到过氧化氢酶的刺激后能够在机体内还原为氧合水,对人体无害;MDA是膜脂质过氧化产物,其表达能够直观反映心肌细胞氧化应激程度。本研究结果显示,ISO组大鼠氧化应激水平显著降低,提示ISO能够显著减轻心肌缺血大鼠氧化应激反应,以对抗大鼠心肌I/R损伤。

综上所述,ISO对心肌I/R损伤可产生保护之效,其机制可能与β2-AR兴奋、PI3K-Akt途径激活有关,能够有效抑制心肌细胞凋亡,起到抗氧化应激之效;但因ISO在使用期间可能导致心肌损伤,诱发心律失常,故对于ISO应用的安全性机制还待深入研究,其用于心肌I/R损伤的治疗仍需要在未来进行大量研究加以证实。

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