抗菌肽NK-lysin生物信息学分析及其抑菌作用研究

赖隆永，刘友霖，刘小龙，谭礼宁，吴昌标，杨 慧，余勋信，杨守深，徐 磊,5*

(1.派生特(福州)生物科技有限公司，福建 福州 350500；2.福建农业职业技术学院，福建 福州 350303；3.福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350007；4.龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；5.南京天邦生物科技有限公司，江苏 南京 211102)

在抗生素大量使用的今天，细菌对抗生素产生的广泛耐药性以及由此造成的环境污染，已经对人们的健康构成了威胁[1]。因而寻找和开发新一代抗菌药物是当今研究的热点，猪源抗菌肽已成为人们关注的焦点之一[2]。目前已经从猪体内发现了12种以上不同的猪源抗菌肽，包括，PR-39、PMAP-23和NK-lysin等，这些猪源抗菌肽对多种微生物有广谱杀菌作用。其中，NK-lysin可以直接结合脂多糖的类脂部分，可抗各种细菌、真菌如大肠杆菌、巨大型芽孢杆菌、乙酸钙不动杆菌等，甚至还可以溶解一些肿瘤细胞[3]。NK-lysin的抗微生物和溶解肿瘤活性被认为是由于它具有脂质作用，其两亲性与螺旋结构在细胞膜上形成孔道，完整的二硫键对于其抗微生物活性是必需的[4]。

猪源抗菌肽NK-lysin是一种由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的抗菌肽[5]，已经在多种生物体中鉴定出猪源抗菌肽NK-lysin相似物，其中一些生物体具有抗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗菌活性[6,7]。杨霞等[8]研究表明合成绵羊抗菌肽NK-lysin对大肠杆菌、沙门氏菌具有抑制活性，在治疗雏鸡沙门氏菌攻毒的过程中能够明显降低死亡率，对雏鸡心脏、肝脏、肾脏的病理损伤也明显小于对照组。然而，猪源抗菌肽NK-lysin(78个残基)的片段长度使得化学合成或生物合成变得困难[9]。闫洁熙以哺乳动物NK-lysin为模板进行了深入的研究，发现NK-lysin通过破坏癌细胞的细胞膜完整性对包括耐药癌细胞在内的一系列癌细胞表现出较高的抗癌活性；同时，NK-lysin通过扰动细菌外壁、干扰细胞质膜并与细菌细胞质内DNA相结合的双重作用机制发挥抗菌活性，能够迅速并剂量依赖性地抑制和杀死革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌[10]。

在抗生素使用日益严重的形势下[11-13]，猪源抗菌肽的价值和前景显而易见。然而猪源抗菌肽在小鼠体内的抑菌效果尚不明确，在化学合成上出现了很多的问题。本文以小鼠为研究对象，通过对其腹腔注射猪源抗菌肽和大肠杆菌，观察小鼠对大肠杆菌的免疫预防和治疗效果，并PCR扩增、测序得到猪源抗菌肽NK-lysin的基因序列，对猪源抗菌肽NK-lysin的理化性质和蛋白结构进行分析，加强了猪源抗菌肽的基础性研究和生物学功能与作用机制等方面的研究，对开发与利用猪源抗菌肽具有重要的意义。

1 试验材料与方法

1.1 材料

猪源抗菌肽，多肽含量不低于300 μg/mL，由派生特(福州)生物科技有限公司按照已授权国家发明专利[14]制备；大肠杆菌(ATCC 25922)由龙岩学院杨守深博士馈赠；7日龄昆明小鼠，购自吴氏实验动物。

1.2 主要试剂

麦康凯培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、RNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、PCR 试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、DL2000 DNA Maker(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限)、利福平(Sigma公司)等。

1.3 主要设备

离心机(冠森生物上海公司)、Thermo Hybaid px2 thermal cycler PCR仪(美国，Thermo Electron公司)、电泳仪和凝胶成像系统VerSa Doc2000(美国，Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 引物设计和合成 通过基因序列分析软件和引物设计分析软件DNAman 6.0和Primer Premier 5.0，参考公开发表的猪源抗菌肽NK-lysin(Genbank: X85431.1)共保守区段设计引物AMP-234F和AMP-234R，可以扩增出234 bp的NK-lysin基因序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1 猪源抗菌肽NK-lysin的引物信息

1.4.2 目的片段扩增 取17～18周龄健康猪的新鲜小肠组织，根据试剂盒说明书提取RNA，-80 ℃保存或立即反转录成cDNA。在20 μL体系中进行反转录，42 ℃反转录15 min，70 ℃ 15 min，4 ℃保存；将得到的产物再用引物AMP-234F和AMP-234R进行PCR扩增，95 ℃预变性5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取扩增完成的PCR产物30 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因片段大小，与标准的DL2000 DNA Marker进行比较，观察是否扩增出了234 bp的特异性片段。

1.4.3 PCR产物测序 将经过PCR扩增鉴定与预计相一致的片段长度为234 bp的条带切下，根据琼脂糖凝胶回收试剂盒操作步骤回收目的基因，送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.4.4 抗菌肽NK-lysin的生物信息学分析 根据测序结果，通过DNAman软件对猪源抗菌肽NK-lysin序列与NCBI登录的猪、家禽、鱼类、绵羊和牛的NK-lysin序列进行基因序列同源性比较并绘制遗传关系图谱；通过ProParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)对其基本性质进行分析；通过SOPMA tool(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)对其二级结构进行预测，并通过PHD数据库查找其3D结构；通过 String tool(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=5RWaH208azBm&input_page_show_search=on)进行蛋白互作网络分析[15]。

1.4.5 大肠杆菌的培养和纯化 将保存于-80 ℃的大肠杆菌菌株室温解冻，取少量接种于麦康凯液体培养基中，于摇床150 r/min、37 ℃培养18 h，用无菌接种环蘸取菌液，于麦康凯琼脂平板表面划线，37 ℃培养24 h。用无菌环挑取典型菌落，接种于10 mL液体麦康凯培养基中，于摇床150 r/min、37 ℃培养24 h，保存于4 ℃备用。

1.4.6 药物敏感性试验 药敏试验按常规K-B法进行，挑取分离培养的单个大肠杆菌典型菌落增菌后均匀涂布在麦康凯平板上，用无菌镊子将含有猪源抗菌肽成分的自制纸片(浸泡用药液体积比为猪源抗菌肽∶水=1∶9)和利福平纸片紧贴于琼脂表面，用无菌水制成的纸片做对照，每组3个重复，置37 ℃恒温箱内18 h后，观察结果。

1.4.7 大肠杆菌半数致死量(Median Lethal Dose，LD50)测定 大肠杆菌用液体麦康凯培养基稀释成不同浓度，冰箱保存备用。随机选取试验小鼠90只，分为6组，6个攻毒组浓度分别为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/mL，腹腔注射攻毒，0.2 mL/只。接种后观察各组试验小鼠的呼吸、精神、采食、饮水、粪便等临床情况。观察24 h，记录死亡情况，计算大肠杆菌的LD50。

1.4.8 抗菌肽对小鼠感染大肠杆菌的预防作用 试验动物在进行动物试验前饲喂1周(饲料中不含任何抗生素)，使其适应试验环境，确定健康后方可进行试验。根据1.4.7测定结果确定菌液浓度，分组结果见表2。预防组每只小鼠腹腔注射0.2 mL猪源抗菌肽，细菌模型组注射等量生理盐水；24 h后，预防组和细菌模型组每组以LD50腹腔注射大肠杆菌菌液0.2 mL/只，攻毒后，观察各组试验小鼠的呼吸、精神、采食、饮水、粪便等临床情况。治疗组以LD50腹腔注射大肠杆菌菌液0.2 mL/只，观察各组试验小鼠的呼吸、精神、采食、饮水、粪便等临床情况，12 h后每只小鼠腹腔注射0.2 mL猪源抗菌肽。

表2 试验分组及给药

2 结果与分析

2.1 抗菌肽NK-lysin的RT-PCR扩增结果

将由猪小肠组织提取的RNA反转录后进行扩增，得到大小为234 bp的目的基因条带(见图1)，与预计期望得到的扩增目的基因条带片段大小相一致。

2.2 抗菌肽NK-lysin的生物信息学分析结果

2.2.1 抗菌肽NK-lysin序列同源性分析 将经过PCR扩增鉴定与预计相一致的条带切下，回收目的基因，测序结果见图2。

通过DNAman软件对猪源抗菌肽NK-lysin序列同源性分析发现，所测得的猪源抗菌肽NK-lysin序列与鸡、白鲩、罗非鱼、花鲈和野生日本鸣鹑等物种NK-lysin序列同源性均很低，存在较大的差异，与绵羊和牛的同源性均为69.66%；然而和NCBI登录的猪源抗菌肽的同源性达97.78%(表3)。经过对其他物种的NK-lysin进行进化树的分析，从进化树来看，该猪源抗菌肽与NCBI登录的猪源抗菌肽保持高度同源；同时与家畜绵羊、牛分属于同一分支，而与其他物种有很大变异(图3)。

2.2.2 抗菌肽NK-lysin基本性质分析 通过ProParam tool分析可知，猪源抗菌肽NK-lysin预测的分子量是8834.68，包含78个氨基酸，其中赖氨酸含量最高，达到14.1%，其次是异亮氨酸，为12.8%。该蛋白的分子式为C380H664N112O109S9，理论等电点达到9.47，是一个稳定的蛋白，不稳定系数为36.01。猪源抗菌肽NK-lysin预计的半衰期在哺乳动物网织红细胞(体外)为30 h，在酵母(体内)中为20 h，在大肠杆菌中(体内)大于10 h。

2.2.3 抗菌肽NK-lysin二级结构预测 通过SOPMA tool预测可知，猪源抗菌肽NK-lysin二级结构为：α螺旋区域56个氨基酸，占71.79%；延伸链有7个氨基酸，占8.97%；β转角区域有6个氨基酸，占7.69%；无规则卷曲区域有9个氨基酸，占11.54%。

通过PHD数据库查找，得到其3D结构模型图(图4)。

M：DL2000 Marker；1：猪小肠组织；+：阳性对照；-：阴性对照

图2 PCR产物测序结果

表3 猪源抗菌肽NK-lysin序列与NCBI登录的NK-lysin序列的同源性

图3 猪源抗菌肽NK-lysin的遗传进化树分析

2.2.4 抗菌肽NK-lysin互作网络分析 通过String tool进行蛋白互作网络分析，表明猪源抗菌肽NK-lysin可以与4个蛋白发生相互作用，分别是IL-2、GZMB、ENSSSCG00000024337和SRRT(图5)。而其中的ENSSSCG00000024337和SRRT为非特征性蛋白。

图4 猪源抗菌肽NK-lysin的3D结构模型

图5 猪源抗菌肽NK-lysin互作网络分析结果

2.3 药物敏感性试验结果

猪源抗菌肽对大肠杆菌的体外抑制作用见表4。由表4可知，猪源抗菌肽和利福平对大肠杆菌都具有抑菌作用，但是猪源抗菌肽的抑菌圈直径比利福平大，抑菌作用比利福平的抑菌作用强。

表4 药物敏感性试验结果

2.4 LD50的确定

小鼠人工感染大肠杆菌4 h后，各组试验小鼠出现不同程度大肠杆菌感染症状，如精神沉郁、采食和饮水减少、腹泻等临床情况。各组小鼠死亡多发生在24～36 h。各组试验小鼠的死亡情况见表5。通过公式，计算得到大肠杆菌的LD50=1.0×105.75cfu/mL，选用这个浓度为攻毒浓度，剂量为0.2 mL/只。

2.5 抗菌肽预防试验结果

根据2.4测定结果确定菌液浓度，预防组每只小鼠腹腔注射0.2 mL猪源抗菌肽；24 h后，预防组和细菌组，每组以1.0×105.75cfu/mL腹腔注射大肠杆菌菌液，攻毒后，细菌模型组陆续出现大肠杆菌感染症状，如精神沉郁、采食和饮水减少、腹泻等临床情况，直至死亡；而预防组起初少部分出现大肠杆菌感染症状，但后期出现恢复，最终的预防组存活率(80.00%)高于细菌模型组(46.67%)。而治疗组在腹腔注射大肠杆菌菌液后陆续出现大肠杆菌感染症状，在其死亡前，即12 h，腹腔注射猪源抗菌肽，存活率达到了86.67%。各组试验小鼠的存活情况见表6。

表5 各组试验小鼠的死亡情况

表6 各组试验小鼠的存活情况

3 讨论

试验通过提取猪小肠组织RNA、PCR扩增和测序得到猪源抗菌肽序列。通过分析发现，猪源抗菌肽与NCBI登录的猪源抗菌肽同源性很高，而与其他物种的同源性很低。鸡源和牛蛙抗菌肽NK-lysin的生物学功能已经明确，并有对其基本性质和二级结构进行分析[16-17]。王鹏等发现牛蛙抗菌肽粗提物具有稳定的生物学活性，能够减缓蛋鸡产蛋性能的衰退，并能够提高蛋鸡的蛋品质与免疫力[18]。对猪源抗菌肽NK-lysin的生物信息学分析具有重要意义，也可为猪源抗菌肽NK-lysin的生物学功能研究提供参考。通过ProParam tool分析发现，猪源抗菌肽在大肠杆菌中(体内)的半衰期大于10 h，远长于其他来源抗菌肽的半衰期，这很可能与其具有抑菌作用有重要联系，为进一步研究其作用机理提供了方向。

GZMB是外源性的丝氨酸蛋白酶，来自细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)和自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK)释放的细胞浆颗粒。有研究表明GZMB破坏了细菌的中间代谢和蛋白质合成，从而促成免疫细胞的死亡计划[19]。而IL-2是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th细胞(Helper T cell)和CTL的增殖，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。有研究表明IL-2明显延长结核杆菌H37RV株感染小鼠和豚鼠的半数死亡时间，降低死亡率，减少感染动物脾、肺组织内的结核杆菌数[20]。通过String tool进行蛋白互作网络分析发现，猪源抗菌肽NK-lysin与IL-2和GZMb发生相互作用，因此很有可能是猪源抗菌肽NK-lysin激活了相关通路，使得IL-2和GZMb的表达量上调，提高机体免疫力，破坏细菌的生长和合成，从而起到抑菌的作用。

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。陈社生[21]应用利福平治疗人工诱发的鸡大肠杆菌病，发现利福平可溶性粉剂对细菌性疾病有很好的疗效，在生产上值得推广应用。因此，本文选择利福平作为参照，发现猪源抗菌肽的抑菌圈比利福平大，抑菌作用强。另外，细菌的耐药性问题应引起注意，长期使用某一药物很容易产生耐药性，导致救治无效，造成重大经济损失。本研究结果对开发新一代的抗菌药物抗菌肽意义重大。

猪源抗菌肽NK-lysin最初是从猪的脾脏、骨髓和大肠中分离到，该基因编码的多肽与人颗粒溶素(Granulysin，GNLY)具有相似结构和抗菌特性，对细菌、真菌、原生动物、寄生虫、肿瘤细胞等具有广泛抑制杀灭活性[22-23]，其将成为抗生素的代替品，从而减少抗生素的使用。然而，对于猪源抗菌肽的研究仅仅停留在体外的抑菌试验，其在动物体内的抑菌效果尚不明确。本研究发现：腹腔注射猪源抗菌肽的预防组小鼠，具有较强的大肠杆菌抵抗力，存活率达到80.00%；治疗组在腹腔注射大肠杆菌菌液后陆续出现大肠杆菌感染症状，在其死亡前，即12 h，腹腔注射猪源抗菌肽，存活率达到了86.67%。说明猪源抗菌肽对大肠杆菌病具有预防和治疗效果。