凤丹果实的多果性状及其形成机制研究

史明伟，祝有为，言燕华，韦武青，徐迎春*

(1.南京农业大学 园艺学院，江苏 南京 210095；2.镇江市润州区林业果茶指导站，江苏 镇江 212000；3.镇江市蔬菜研究所，江苏 镇江 212021)

油用牡丹是指种子可加工牡丹籽油的一类牡丹品种。其中凤丹(Paeoniaostii)由于结实率高，种子产量大，生长适应性强，作为主要栽培的油用牡丹品种在全国大面积推广。凤丹是由杨山牡丹长期栽培演化形成的观赏兼药用的品种群[1]，与观赏用的牡丹(P.suffruticosa)并列为植物学上的种，为江南牡丹品种群的一个亚群[2-3]。凤丹属于异花授粉植物，虽有一定的自交亲和性，但自交亲和性很差[4]，需要进行异花异株授粉。长期以来一直用种子繁殖苗木，形成了丰富的自然变异类群。

凤丹的果实为蓇葖果，由多个小果组成，具有多个心皮。一般认为凤丹具3～8枚小果[5]，多数品种为5枚。但据沈保安等[6]研究，安徽铜陵凤凰山和安徽南陵丫山产的凤丹有一个类群的蓇葖果通常6～8枚，将其定名为多果牡丹PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang ssp.lishizhenenii(B.A.Shen)。作者在安徽铜陵的凤丹田里发现了若干具有6～8枚蓇葖果特征的凤丹单株，与沈保安所述的多果牡丹在形态上相似。关于多果牡丹目前只有植物学外观形态特征方面的证据[6]，尚缺乏更科学、更精确的证据以证实其多果特性是一种特异的遗传性状。凤丹果实的蓇葖果由离生心皮雌蕊发育而来，心皮数量决定了最终蓇葖果的数量，凤丹多果性状的产生可能受与心皮发育相关基因的调控，目前为止尚未发现关于凤丹果荚果数的研究报道。

为研究该变异的类型和产生的原因，本试验选取上一年所结果实分别为5果、6果、7果、8果的凤丹进行人工异花授粉，试图探究凤丹的多果性状是否可以稳定表达；并且从相关研究文献中找到与心皮发育相关的基因[7-9]，在凤丹转录组中找到同源基因，选取多果凤丹花芽为材料，检测凤丹中与心皮发育相关的基因在不同果数凤丹花芽中的相对表达量，试图找出可能与凤丹多果性状产生相关的基因。同时，通过观察多果凤丹的生物学特性，以找出多果凤丹与普通凤丹的异同，从而研究凤丹果实果数与产量之间的关系，为进一步探究凤丹多果性状产生的原因及培育高产的凤丹新品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2014年6月，在安徽铜陵凤凰山凤丹生产基地6年生凤丹植株中，选取了40个具有多果性状的凤丹单株，分别标记。单株全部果实小果数均为6、7、8个的植株分别标记为6、7、8果凤丹(图1)，以5果普通凤丹作为对照。

图1 不同果数凤丹的果实

1.2 多果凤丹植株的生长特性观测

2015年2月15日至5月15日，在凤丹结果期之前，分别观察记录不同生长时期5果、6果、7果、8果凤丹的生物学特征及物候期。观测内容为：萌芽期的芽数、芽长与芽宽(每株观测3个芽)，盛花期单株着花数、花直径、花期。每组观察10株。

5月至8月，从结果期至果实采收期对凤丹结果期的生物学特征进行观察记录，具体内容为：株高、冠幅、结果枝叶片数、结果母枝长度与粗度(每株观测3个母枝)。每组观测10株。

8月初至9月初，采收成熟的蓇葖果，测量蓇葖果的鲜重、小果的长度、厚度及种子的千粒重，统计单果种子数。

1.3 多果凤丹植株后代性状分离情况

2016年4月，按果数不同分别编号A(5果凤丹)、B(6果凤丹)、C(7果凤丹)、D(8果凤丹)，每种果数的凤丹选取5株进行试验，每株选择3朵花作为母本，每个母本所授的花粉采自相同果数的其它凤丹单株，分别标记授粉。授粉后，观察并记录每朵花上的心皮数量；8月初统计每组自交授粉后的果数，计算不同蓇葖果数量的果实占总果实数量的比例。

1.4 心皮发育相关基因在多果凤丹中相对表达量的测定

在凤丹转录组文库中筛选了凤丹中与心皮发育相关的6个基因，分别为AGAMOUS-1(AG-1)、AGAMOUS-2(AG-2)、AGAMOUS-like8-1(AGL8-1)、AGAMOUS-like8-2(AGL8-2)、AGAMOUS-like62(AGL62)、SPATULA(SPT)。并以前人的研究为基础，选取了看家基因ubiquitin作为内参基因[10]。根据定量PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5.0和Beacon designer 7软件同时设计6个目的基因的引物，并在NCBI Primer-Blast上对引物的特异性进行检测，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物具体序列见表1。

表1 Real-time PCR检测中所用基因的引物序列

1.5 数据处理与分析

采用Excel 2007和SPSS软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 多果凤丹的生物学特性

2.1.1 多果凤丹株高、冠幅、结果枝的特性 从株高和冠幅的测量结果(表2)可以看出多果凤丹和普通5果凤丹在株高和冠幅方面没有显著区别。观察结果(表3)显示多果凤丹和普通5果凤丹之间结果枝长度、结果枝粗度、结果枝上的复叶数、结果母枝长度以及母枝粗度均没有显著区别，结果枝长度在45～50 cm，粗度在10～13 mm，复叶数在11～12片；结果母枝长度在14～17 cm，粗度在16～17 mm。多果凤丹果实结果枝的长度、粗度可以反映多果凤丹所在枝条的营养贮藏状况，可见不同果数凤丹枝条贮藏的营养并无显著区别。

表2 不同果数凤丹的株高、冠幅

表3 不同果数凤丹结果枝的生长特性

2.1.2 多果凤丹芽的特性 观察多果凤丹在萌芽期芽的部分特性(表4)，结果显示不同果数的凤丹在芽数量和芽长度上无明显区别，芽数均在17～20个，芽长在4.2～4.6 cm。但多果凤丹的芽宽均大于5果凤丹，其中以8果凤丹的芽宽最大，7果凤丹次之，6果凤丹的芽宽稍高于对照，而从芽的长宽比也可以看出这种差别。

表4 不同果数凤丹芽的特性

2.1.3 多果凤丹的开花特性 从4月中旬开始，分别观测多果凤丹盛花期的着花数、花直径以及开花持续时间(表5)。结果显示：不同果数凤丹之间在着花数和花期方面没有显著区别，由于引种时间短，每株凤丹上的着花数都不多，平均在3个左右，少数出现5～7朵花，花期持续时间均在13～14 d。但从花朵直径来看，多果凤丹尤其是7果、8果凤丹的花朵直径要大于5果凤丹和6果凤丹。

表5 不同果数凤丹的开花特性

2.1.4 多果凤丹人工异花授粉后性状分离情况 通过对结实后果实心皮(表6)的观察发现，多果凤丹的果数与前一年相比发生了较大变化。在单株凤丹上结的果实出现不同果数的现象，原5果凤丹果实果数变化不大，授粉后15朵花有1朵结出的果实枯萎，没有结籽，其余14朵仍为5果果实，占5果凤丹所结果实数量的100%；而原6果凤丹中出现了47%五果的果实和53% 6果的果实；原7果凤丹所结果实中五果果实占33%，六果果实占20%，7果果实数量最多，占47%；原8果凤丹中15朵花也全部结实，5果、6果、7果、8果的果实都有，在所结果实总量的比例分别为27%、20%、27%、26%。

另外，在授粉后，聚合心皮刚刚分离时对心皮数量的观察发现，有少数授粉后的花心皮数量超过8个，最多的达到10个心皮，但绝大多数花的心皮数仍为5～8个(图2)。后续观察发现，多心皮的花多数心皮在发育过程中会逐渐萎蔫、脱落，最终会留下5～8个心皮发育成熟。

A：心皮数为5；B：心皮数为7；C：心皮数为10。

2.1.5 多果凤丹成熟果实和种子品质的情况 考察多果凤丹果实和种子的品质特征，可以看出(表7)，不同果数凤丹新采单个果实的大小(直径和厚度)基本没有变化，但果实的鲜重随着蓇葖果数量的增加而增大。单果结籽数同样随着单个果实蓇葖果数量的增加而增多，说明果荚数量的增多会带来单果结籽量的增大。而从作为种子质量的重要指标之一的千粒重来看，6果、7果凤丹的种子较5果凤丹种子更加饱满，但8果凤丹虽然单果结籽量最大，但千粒重最小。

2.2 心皮发育相关基因在多果凤丹中的表达特征

本试验通过实时荧光定量的方法测定了凤丹中6个与心皮发育相关的基因分别在5果、6果、7果、8果凤丹中的相对表达量。从图3可以看出，各目的基因在不同果数凤丹中的表达情况也各不相同。AG-1和AG-2在普通5果凤丹中的相对表达量最高，而它们在6果、7果和8果凤丹中相对表达量差别不大，却都明显低于在普通5果凤丹中的相对表达量。AGL8-1和AGL62同样在普通5果凤丹中表达量最高，而随着果数增加，这两个基因的相对表达量呈逐渐减少的趋势，且在8果凤丹中的相对表达量都显著低于5果凤丹。AGL8-2在不同果数凤丹中的表达情况相似，没有明显差别，但在8果凤丹中同样表达略少。SPT则在8果凤丹中相对表达量最高，而在6果和7果凤丹中相对表达量又很低，没有呈现出任何规律。

表6 授粉后成熟蓇葖果数量的变化 %

表7 成熟果实和种子的品质指标

图3 实时荧光定量PCR分析凤丹心皮发育相关基因的相对表达量

3 讨论

3.1 多果凤丹的生物学特征

本研究所观测的多果凤丹，其萌芽期、开花期及结果期等基本物候期与普通5果凤丹基本一致，没有显著差异，均在2月中下旬开始萌芽，4月初陆续开花，果实成熟时间一般为8月中上旬。除此之外，多果凤丹的株高、冠幅、萌芽数、着花数、结果枝特性、果实的直径与厚度都与5果凤丹相似，但多果凤丹较5果凤丹的芽、花直径更大，芽长宽比更小。沈保安[6]在安徽发现的多果牡丹花的直径可达到14～20 cm，而本研究观测的多果凤丹花的直径多在9～10 cm，与沈保安发现的多果牡丹有一定的差异，主要原因是本研究观测的是6年生凤丹。此外，除了具8个蓇葖果的凤丹外，其余多果凤丹的千粒重均显著大于正常凤丹果实，这是因为具8个蓇葖果的果实所结种子的数量过多时，种子生长空间受限，营养不足，会使得许多种子干瘪，籽粒不够饱满，种子体积小，进而导致千粒重显著下降。

3.2 心皮发育相关基因在不同果数凤丹中的表达特征

本研究发现，在人工异花授粉后，有些果实开始心皮数较多，随着果实的成熟，有些果实便会逐渐干瘪、脱落，最终得到的蓇葖果数量仍在5～8个，初步推测凤丹多果性状可能是由基因控制的可遗传的性状。拟南芥心皮发育主要受CRABSCLAW及SPT基因的控制，两者都属于MADSbox基因家族成员[11]。赵燕等[11]选取拟南芥和荠菜为材料，将拟南芥CRABSCLAW基因和克隆的荠菜CRABSCLAW同源基因cDNA交互转化后，两者的心皮形态和大小都发生了变化，可见心皮发育受基因调控显著。本试验结果显示，AG-1和AG-2在普通5果凤丹中的相对表达量显著高于其在其他多果凤丹中的相对表达量，可以推测这两个基因的表达有可能会抑制多果的形成。在凤丹果荚形成过程中，我们观察到凤丹授粉后，心皮刚刚分离时，心皮数量可能会多达10个，但最终多出的心皮会在发育过程中萎缩死亡，最终留下5个心皮发育成熟。如果该死亡过程是基因导致的程序性死亡，那么根据多果凤丹中AG-1和AG-2两个基因的表达量显著减少，推测AG-1和AG-2基因有可能参与调控多余心皮的程序性死亡。AGL8-1和AGL62的相对表达量会随着果数增加呈逐渐减少的趋势，且在8果凤丹中的相对表达量都显著低于5果凤丹。由此推测，AGL8-1和AGL62基因也可能参与了凤丹果荚果数最终形成的过程，这两个基因的表达量可能与最终凤丹果荚成熟时心皮的数量有关。

综合上述试验结果来看，多果凤丹比普通凤丹芽直径、花朵大，千粒重大，其他生物学特性基本一致。凤丹多果性状可能是由控制心皮发育的相关基因AG-1、AG-2、AGL8-1和AGL62调控的，后续还需进行嫁接试验来进一步验证多果性状是否为可遗传的特异性状；7果凤丹结籽量大，种子饱满，果实重量适中，符合高产优质的育种要求，可以作为优良品种进行选育。