高效液相色谱法测定不同产地蒲黄药材中3种黄酮苷元含量

杨棣华，梁文能

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.、东方香蒲T.orientalisPresl或同属植物的干燥花粉，通常夏季采收，筛取花粉，作为药用［1］。临床主要用生品蒲黄和蒲黄炭，二者作用稍有不同，生品主要用于活血化瘀，蒲黄炭主要用于外伤出血［2-3］。蒲黄的主要活性成分为黄酮苷及苷元［4-5］。2015 年版《中国药典（一部）》中采用薄层色谱和液相色谱对其苷元香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷进行测定［1］。黄酮苷和苷元在药理中都具有活性，黄酮苷类化合物也具有活血化瘀作用［6-7］。目前，对于黄酮苷类的测定方法主要有紫外光谱法［8-9］、毛细管电泳法［10］、高效液相色谱法［11-12］等，本研究中根据黄酮苷的化学性质并参考文献［13］建立高效液相色谱法，测定不同产地蒲黄中3种黄酮苷元的含量并比较其差异，为优化蒲黄的质量和临床使用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ulitimate3000型高效液相色谱仪，包括四元洗脱泵，DAD检测器和变色龙工作站（美国赛默飞世尔仪器公司）；BSA-124S型电子天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

槲皮素对照品（批号为100081-201408，质量分数为 99.1%），山柰素对照品（批号为 110861-201310，质量分数为93.2%），异鼠李素对照品（批号为110860-201109，质量分数为99.0%），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水（美国Milli-Q公司）；磷酸（分析纯，国药试剂化学有限公司）；蒲黄药材分别来源于江苏、内蒙古、陕西、安徽、宁夏、湖北、四川、广西8个不同产地的12批药材（见表1），经我院梁文能副主任药师鉴定为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.的干燥花粉，均符合药典要求。

表1 不同产地蒲黄药材样品

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Hypersil BDS-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（50 ∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm；进样量：10 μL。在此色谱条件下，理论板数按槲皮素峰计不低于 3690，拖尾因子为 0.95 ～1.05，各色谱峰分离度均大于1.5。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取置五氧化二磷干燥12 h以上的槲皮素10.12 mg，精密称定，置 25 mL容量瓶中，山柰素 5.82 mg置25 mL容量瓶中，异鼠李素6.05 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇分别稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密吸取上述槲皮素对照品贮备液1 mL、山柰素对照品贮备液1 mL和异鼠李素对照品贮备液5 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液（每1 mL含槲皮素40.48 μg、山柰素23.28 μg、异鼠李素 60.50 μg）。取浙江湖州产的蒲黄药材粉碎，过4号筛，取粉末1.0 g，精密称定，精密加入甲醇 -25%盐酸溶液（4∶1，V/V）的混合溶液 25 mL，加热回流提取1 h，迅速冷却至室温，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取对照品混合溶液1，2，5，10，25 μL，分别注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X，ng）为横坐标、相对应的峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 方法学考察结果

精密度试验：取对照品混合溶液，按拟订色谱条件进样10 μL，重复6次，记录峰面积。结果见表2，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品（批号为180501）溶液，按拟订色谱条件分别于 0，1，2，4，8，12，24 h 时进样测定，进样量为10 μL，记录色谱峰面积。结果见表2，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批蒲黄药材（批号为180501），依法制备供试品溶液，平行6份，按拟订色谱条件进样测定。结果见表2，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的蒲黄药材（批号为 180501）粉末 0.50 g，平行制备 6份供试品；分别精密吸取槲皮素贮备液3 mL，置10 mL容量瓶中（每1 mL含槲皮素0.1214 mg）作为待加溶液，分别精密量取上述槲皮素待加对照品溶液1 mL，山柰素对照品贮备液1 mL，异鼠李素对照品贮备溶液3 mL，加入6份供试品中，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，分别计算回收率。结果见表3。

2.4 样品含量测定

取上述不同产地的样品，依法制备供试品溶液并测定，用标准曲线法计算含量（以干燥品计）。结果见表4。

3 讨论

按《中国药典（一部）》蒲黄含量测定的取样量进行考察，分别取样 0.5，1.0，2.0 g。当取样量少时，色谱峰面积较小，基线噪音干扰较大；取样量太大，则对照品称样需要增大，易造成对照品浪费。故选择1.0 g作为取样量。参照银杏叶中3种黄酮苷的测定方法对供试品溶液的制备方法进行考察，考察了盐酸的不同比例（甲醇-10%盐酸溶液、甲醇-25%盐酸溶液、甲醇-35%盐酸溶液）、不同提取方式（超声、回流、索氏提取）、不同提取时间（30，60，90 min）。结果发现，甲醇和盐酸的用量对3种黄酮苷元的含量影响很大。盐酸浓度低，水解不完全，提取率低；盐酸浓度大，对液相色谱的管路有腐蚀作用，同时酸浓度过大对色谱柱的要求较高，影响其适用性。综合考虑，采用25%盐酸溶液进行水解，同时对甲醇 -25%盐酸溶液不同体积比（1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1，8 ∶1，10 ∶1，V/V）进行考察，结果甲醇 -25%盐酸溶液（4 ∶1，V/V）提取效率最高，回流和索氏提取效率基本一致，均高于超声，由于回流方法简单，故采用回流提取。提取时间在60 min以后含量基本不变，故采用提取时间为60 min，综合考虑选择甲醇 -25%盐酸溶液（4 ∶1，V/V），回流提取60 min作为供试品溶液的制备方法。

表33种黄酮苷元的加样回收结果（n=6）

表4 不同产地蒲黄药材中3种黄酮苷含量测定结果（mg/g，n=2）

参考2015年版《中国药典（一部）》银杏叶药材及其制剂［13］项下含量测定条件，对色谱条件中的流动相和检测波长进行了考察，采用DAD检测器在200～400 nm波长内进行全波长扫描，分别结合槲皮素、山柰素和异鼠李素3种对照品的光谱图进行比较，最后选择检测波长为360 nm。考察流动相的组分，分别以甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水和甲醇-水作为流动相，结果发现以甲醇-水和乙腈-水作为流动相时，异鼠李素的峰均有拖尾现象，对称因子较低，而采用甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相时，供试品中3种成分的色谱法峰形良好，基线平稳，对称因子为0.95～1.05内，理论板数高，阴性对照无干扰。故确定甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，检测波长为360 nm，与《中国药典（一部）》中银杏叶项下色谱条件一致。

本研究结果显示，不同产地的蒲黄药材中3种黄酮苷的含量差异较大，广西桂林产的蒲黄药材中3种黄酮苷类成分含量最高，槲皮素为0.3721 mg/g，山柰素为0.4173 mg/g，异鼠李素为 1.7028 mg/g，这可能与当地气候和生长环境有关。蒲黄多生长在沼泽湖泊周围等水量充足的地方，宁夏固原产和内蒙古包头产的蒲黄药材中3种黄酮苷元成分含量最低，可能与当地降雨量少有关。可见，不同产地蒲黄药材中3种黄酮苷类成分差异较大，故建议增加黄酮苷类化合物作为蒲黄药材的质控指标。不同产地蒲黄药材对其临床使用具有一定影响，临床使用蒲黄药材应多采购广西、江苏、湖北等地的，可保证药效的最大限度发挥，同时为开发和利用蒲黄药材的药用价值提供参考。