柳珊瑚Leptogorgia rigida中甾体类成分研究

肖细姬, 邓芸, 谢路凤, 张琪, 韦霞, 于鑫, 张翠仙

柳珊瑚中甾体类成分研究

肖细姬, 邓芸, 谢路凤, 张琪, 韦霞, 于鑫, 张翠仙

广州中医药大学中药学院, 广东 广州 510006

首次对南海柳珊瑚中甾体类次生代谢产物进行研究。采用硅胶柱柱层析、十八烷基硅烷键合硅胶填料、Sephadex LH-20、高效液相色谱(HPLC)及薄层色谱(TLC)等多种方法进行分离纯化, 通过核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)等现代波谱分析及物理常数对照等方法进行结构鉴定。从南海柳珊瑚次生代谢产物中分离得到8个甾类化合物, 结构依次为: 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (1); 3, 6, 11- trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-trihydroxy-5-chloest-7, 22()-dien-9-one (3); pregnan-4-en-3, 20-dione (4); 5-pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy-pregnan-5-en-20-dion (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); 和3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-gorgosterol (8)。所有化合物均首次从属中得到。

南海柳珊瑚; 甾类化合物; 断甾醇; 结构鉴定

海洋生物由于其高压、高盐、低温、寡营养、无光照等特殊的海洋生境, 使得其次生代谢产物与陆生生物相比在化学结构类型上更丰富, 其药理活性更多样, 因此引发化学、医药类学者的广泛关注(Blunt et al, 2014-2018)。目前报道的柳珊瑚化学成分主要有三大类: 萜类、甾醇和生物碱, 且以二萜为主(柴兴云等, 2012; 高程海等, 2013; Blunt et al, 2014-2018)。SciFinder检索发现, 目前对属柳珊瑚次生代谢产物的研究较少, 仅有(Ksebati et al, 1984)、(Cimino et al, 1984; Garrido et al, 2000; Boonananwong et al, 2008)、(Kingsley et al, 2001)(Gutiérrez et al, 2005)(Gutiérrez et al, 2005)(Keyzers et al, 2006)(Ortega et al, 2008)、(Moritz et al, 2014)和(Mirallès et al, 1995)等柳珊瑚的相关报道, 其化学成分主要涉及西松烷二萜类和甾体两大类。

本文首次对产自我国南海海域的属柳珊瑚的次生代谢产物进行研究, 共分离得到8个甾体类化合物, 经过现代波谱分析(核磁、MS等)及物理常数对照等方法确定其结构依次为: 3, 6, 11- trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (1); 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7, 22 ()-dien- 9- one (3); pregnan-4-en-3, 20-dione (4); 5- pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy-pregnan-5-en- 20-dione (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); 柳珊瑚甾醇 (8)。所有化合物均首次从属柳珊瑚中得到。

图 1 来源于柳珊瑚Leptogorgia rigida的断甾醇(1~3)和孕甾醇(4~7)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器: 超导核磁共振仪AVANCE AV 400 MHz(瑞士Bruker 公司)、Bruker AVANCE IIIT 600 MHz(瑞士Bruker BioSpin 公司); 质谱仪VG ZABHS(ESI, 美国Finnigan 公司)、质谱仪DSQ(EI, 美国Thermo 公司); 超声波清洗机KQ-500DB(巩义市予华仪器有限责任公司); 分析电子天平ER-120A (日本A&D公司); 恒温水油浴锅RE-2010(巩义市予华仪器有限责任公司); 高效液相色谱仪QuikSep(北京慧德易科技有限责任公司); MCP200 数字式旋光仪(上海桑戈生物科技有限责任公司)。

试剂及材料: 石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇、正丁醇(分析纯AR, 天津市致远精细化工有限公司); ODS(60mm、日本YMC公司)、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(60mm、日本YMC公司); 柱层析硅胶(200~300目)和硅胶GF254(均为青岛海洋化工厂分厂)、HPLC半制备色谱柱Kromasil 100-5-C18 5mm, 10×250mm(瑞士Kromasil公司)。

1.2 样品来源

柳珊瑚SYDLD-7于2004年采自中国南海三亚附近海域, 经中国科学院南海海洋研究所李秀保博士对其进行种属鉴定, 确定其为; 样品标本(编号: SYDLD-7)保存于广州中医药大学中药学院海洋天然产物实验室。

1.3 提取分离

将柳珊瑚(2.6kg, 干重)用工业酒精在室温下浸泡提取(10 L × 4次/7天), 将浸提液减压浓缩得到粗浸膏。用水将该浸膏捏溶, 并且依次用等体积的乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)先后萃取, 分别萃取至萃取液无色, 得到乙酸乙酯部位浸膏48.5g和正丁醇部位浸膏150g。

取乙酸乙酯部位(48.5g)浸膏经正相硅胶(200~ 300目，500g; 柱子直径=12cm, 柱长=60cm)柱粗分, 以石油醚-乙酸乙酯体系(100%、15%、25%、35%、50%、65%、80%、0%)梯度依次洗脱, 经过TLC薄层追踪合并得到10个极性不同的组分(标号为Fr1—Fr10)。Fr4(4.5g)硅胶柱色谱(200~300目, 80g; 柱子=3.0cm,=60cm), 石油醚-乙酸乙酯体系洗脱(85%、80%、75%、70%), TLC追踪合并, 得Fr4-1—Fr4-9。Fr4-4(108 mg)乙酸乙酯重结晶得化合物8(40mg)。Fr4-6(45mg)经Pre-HPLC纯化(Kromasil色谱柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水体系(V甲醇︰V水=8︰2)等度洗脱, 依次得化合物4 (4mg, 保留时间R=12.5min)、6 (3mg,R=14.3min)和7 (8mg,R= 15.5min)。Fr4-8(506mg)经开放Sephdex LH-20 (40~ 60mm, 100g; 层析柱=2cm,=1.8m)柱层析, 氯仿甲醇(V氯仿︰V甲醇=1︰1)等度洗脱, 得3个流份Fr4-8-1—Fr4-8-3。Fr4-8-2(50mg)经Pre-HPLC纯化(Kromasil色谱柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水体系(V甲醇︰V水=65︰35)等度洗脱, 依次得化合物7 (5.5mg,R= 12.5min)。Fr9(0.86mg)经开放的ODS柱层析(60mm, 100g; 层析柱=2.5cm,=65cm)等度甲醇水体系(V甲醇︰V水=7:3)洗脱得Fr9-1和Fr9-2。Fr9-2(38mg)经Pre-HPLC纯化(Kromasil色谱柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水体系(V甲醇︰V水=6:4)等度洗脱, 依次得化合物1(8.0mg,R=13.5min)、2(2.0mg,R=13.0min)、3(2.0mg,R=14.5min)。

1.4 物理常数和波谱数据

化合物1: 白色固体, UV 254nm下有暗斑。[α]D26−10.00° (0.04, MeOH), ESI-MS435 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, CD3OD):dHppm 6.61 (s, 1H), 4.23 (d, 1H, 4.0 Hz), 3.76 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.29 (m, 1H), 1.91 (s, 2H), 1.17 (s, 3H), 1.04 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.92 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.90 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.74 (s, 3H);13C NMR (150 MHz, CD3OD):dCppm 206.2 (s), 149.3 (s), 137.4 (d), 70.8 (d), 69.7 (d), 59.2 (t), 51.6 (d), 49.9 (d), 49.8 (d), 47.2 (t), 46.1 (t), 43.6 (d), 42.2 (t), 40.6 (t), 36.5 (t), 36.0 (d), 33.7 (t), 33.2 (t), 31.3 (t), 29.1 (d), 28.0 (t), 27.1 (t), 25.6 (t), 23.1 (s), 22.9 (s), 19.4 (s), 17.6 (s), 16.5 (s)。

化合物2:白色固体, UV 254nm下有暗斑。[α]D26+20.00° (0.02, MeOH), ESI-MS449 [M+H]+。1H NMR (400MHz, CD3OD):dHppm 6.59 (d, 1H, 1.2Hz), 4.28 (t, 1H, 4.0Hz), 4.21 (dd, 1H, 4.0Hz), 3.84 (s, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 1.90 (m, 2H), 1.16 (s, 3H), 1.05 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.03 (d, 3H, 4.0Hz), 0.72 (s, 3H)。

化合物3: 白色固体, UV 254nm下有暗斑。[α]D26−40.00° (0.02, MeOH), ESI-MS470 [M+H]+。1H NMR (400MHz, CD3OD):dHppm 6.57 (d, 1H, 1.6Hz), 5.28~5.30 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.62(m, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 1.89 (s, 2H), 1.14 (s, 3H), 1.07 (d, 3H, 4.0Hz), 0.95 (d, 3H, 4.0Hz), 0.88 (d, 3H, 4.0Hz), 0.72 (s, 3H)。

化合物4: 白色固体, UV 254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+13.33° (0.03, MeOH), mp. 129~132 ℃, EI MS314 [M]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm 5.74 (s, 1H), 2.53 (t,1H, 4.0 Hz), 0.67 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 2.12 (s, 3H);13C-NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 35.7 (t), 33.9 (t), 199.5 (s), 124.0 (d), 171.0 (s), 32.8 (t), 31.9 (t), 35.6 (d), 53.7 (d), 38.6 (s), 21.0 (t), 38.7 (t), 43.9 (s), 56.0 (d), 24.4 (t), 22.9 (t), 63.5 (d), 17.4 (q), 13.3 (q), 209.3 (s), 31.5 (s)。

化合物5:白色固体, mp. 200~203 ℃, UV 254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸显棕黄色。[α]D20+84.35° (0.147, CHCl3), EI MS 316 [M]+。1H NMR (400MHz, CDCl3):dHppm3.53 (m, 1H), 2.53 (t,1H, 4.0Hz), 0.64 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 2.12 (s,3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 38.5 (t), 38.1 (t), 211.9 (s), 44.6 (t), 46.7 (d), 28.8 (t), 31.6 (t), 35.4 (d), 53.7 (d), 35.7 (s),21.4 (t), 38.9 (t), 44.6 (s), 56.5 (d), 24.4 (t), 22.9 (t), 63.8 (d), 11.4 (q), 13.4 (q), 209.6 (s), 31.5 (q)。

化合物6:白色固体, UV 254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+45.95° (0.037, CHCl3), EI MS316 [M]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm 5.35 (t, 1H, 4.0Hz), 2.53 (t,1H), 0.64 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 2.11 (s, 3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 38.9 (t), 31.6 (t), 71.7 (d), 37.3 (t), 140.8 (s), 121.4 (d), 31.8 (t), 31.9 (d), 54.2 (d), 36.5 (s), 21.2 (t), 38.8 (t), 44.0 (s), 56.9 (d), 24.5 (t), 22.8 (t), 63.7 (d), 19.4 (q), 13.2 (q), 209.5 (s), 31.6 (q)。

化合物7:白色固体, UV 254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+12.00° (0.05, MeOH), mp. 194~196℃, EI MS318 [M]+。1H NMR (400MHz, CDCl3):dHppm 3.59 (m, 1H), 2.52 (t, 1H, 4.0Hz), 0.60 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 2.11 (s,3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 37.0 (t), 32.0 (t), 71.2 (d), 39.1 (t), 44.8 (d), 28.6 (t), 32.0 (t), 31.4 (d), 50.0 (d), 35.5 (s), 21.2 (t), 39.1 (t), 44.2 (s), 56.7 (d), 24.4 (t), 22.8 (t), 63.8 (d), 12.3 (q), 13.4 (q), 209.6 (s), 31.4 (q)。

化合物8:无色针状晶体, 香草醛浓硫酸加热显紫红色。mp. 179~180 ℃, [α]D25−45.00° (1.0, C5H5N)。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm -0.13 (1H, dd, 4.0Hz, 4.0Hz), 0.17 (m, 1H), 0.23 (1H, dd, 8.0Hz, 8.0Hz), 0.45 (dd, 1H, 4.0Hz, 4.0Hz), 0.66 (s, 3H), 0.85 (d, 3H, 6.0Hz), 0.90 (s, 3H), 0.94 (d, 3H, 6.0Hz), 0.95 (d, 3H, H-21, 6.0Hz), 0.95 (d, 3H, 6.0Hz), 1.01 (s, 3H), 1.06 (m, 1H), 1.07 (m, 1H), 1.08 (m, 1H), 1.12 (m, 1H), 1.22 (m, 1H), 1.26 (m, 1H), 1.43 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.48 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.59 (s, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.83 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 1.96 (m, 1H), 1.99 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 2.28 (m, 1H), 3.52 (m, 1H), 5.34 (br d, 4.0Hz, 1H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 140.8 (s), 121.7 (d), 71.9 (d), 58.0 (d), 56.8 (d), 50.8 (d), 50.2 (d), 42.8 (s), 42.4 (t), 39.9 (t), 37.3 (t), 36.6 (s), 35.3 (d), 32.2 (d), 32.0 (d), 32.0 (t), 31.7 (t), 28.3 (t), 25.8 (s), 24.6 (t), 23.9 (t), 22.6 (t), 22.2 (t), 21.5 (t), 21.3 (t), 21.2 (q), 21.1 (q), 19.4 (q), 15.4 (q), 14.3 (q), 11.9 (q)。

2 结构鉴定

化合物1: 白色固体, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26−10.00° (0.04, MeOH)(Aiello et al, 2003), ESI-MS435 [M+H]+, 分子量434。结合NMR(27个碳: 4个季碳, 8个CH, 10个CH2, 5个CH3), 确定结构式为C27H46O4, 不饱和度为5。NMR中给出了1个酮羰基信号(dC206.2, s)和一个三取代的双键氢信号(dH6.61, d, 1.2Hz, 1H与dC149.3, s, 137.4, d), 除此外无任何不饱和信息, 故而确定1含有3个环。NMR的高场部分给出甾体典型18和19角甲基信息:dH1.17 (s, 3H)和0.74 (s, 3H)和3个与次甲基相连的甲基:dH1.04 (d, 3H, 6.4Hz)、0.92 (d, 3H, 6.0Hz)和0.90 (d, 3H, 6.0Hz)。同时还连有两个连氧次甲基[dH3.63 (m, 1H)、3.50 (m, 1H)和dC69.7 (d)、70.8 (d)]和一个羟甲基[(dH3.50 (m, 1H)和dC59.2 (t))。以上信息表明此1可能为断甾醇类化合物。将1的NMR数据与3, 6, 11-三羟基-5-7-烯-9-酮-9, 11-断甾醇对比(Macnevin et al, 2009), 二者基本一致,确定其结构为3, 6, 11-trihydroxy-5-cholest-9, 11-seco-7-en-9-one。

化合物2为白色固体, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26+20.00° (0.02, MeOH)(Liu et al, 2014), ESI-MS449 [M+H]+, 分子量448。与1相比, 2的1H NMR与其极其相似, 低场有相同的双键信息: 6.59 (d, 1H, 1.2Hz), 4.21 (dd, 1H, 4.0Hz)。不同的是高场有6个甲基信号:dH1.16 (s, 3H), 1.05 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.03 (d, 3H, 4.0Hz)和0.72 (s, 3H)。比化合物1多了一个与次甲基相连的甲基。将2的NMR数据与3, 6, 11-三羟基-5-7-烯-9-酮-9, 11-断甾醇数据对照(Aiello et al, 2003), 二者基本一致, 故而确定2为3, 6, 11-trihydroxy-5cholest-9, 11-seco-7-en-9-one。

化合物3为白色固体, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26−40.00° (0.02, MeOH), ESI-MS470 [M+H]+, 分子量469。与1相比, 二者极为相似, 在dH6.57 (d, 1H)和4.20 (m, 1H)处有相似的双键氢信号, 可见其母核是同样的6位含羟基取代、7位含双键、9位含酮羰基的断甾醇。而dH5.28~5.30 (m, 2H)显示3还具有一个双键, 而dH1.90 (s, 3H)显示该化合物具有一个乙酰基。将3的1H-NMR数据与3, 6, 11-三羟基-7, 22()-二烯-9-酮-9, 11断甾醇对照(Aiello et al, 2003), 二者基本一致, 故而确定其结构为3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-cholest-7, 22()-dien-9-one。

化合物4为白色固体, 紫外254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+13.33° (0.03, MeOH)(Pauli et al, 2010), EI MS给出分子量314(314 [M]+), 结合13C NMR (21个碳: 5个季碳, 5个CH, 8个CH2和3个CH3), 确定其分子式为C21H30O2, 不饱和度7。NMR给出4具有一个孤立的酮羰基(dC209.3, s)、一个共轭酮羰基(dC199.5, s)和一个三取代双键(dH5.74, s, 1H与dC171.0, s; 124.0, d), 除此外无任何不饱和度信息, 说明其含有4个环。同时NMR给出甾体类典型的18, 19角甲基信息[dH0.67 (s, 3H)和1.19 (s, 3H)]。暗示化合物4为孕甾烷类化合物。A环中4-, 5-位双键(dH5.74, s, 1H与dC171.0, s; 124.0, d)由于其与酮羰基共轭, 故而向低场移动23 ppm。NMR中dH6.01 (s, 1H)和dC130.0 (d)、147.2 (s)为甾体3-OH和D4,5类型特征吸收(刘虹等, 2004)。将4的NMR数据与4-烯-3, 20-二酮孕甾烷对照(温燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴兴云等, 2011), 二者基本一致, 故而鉴定4结构为pregnan- 4-en-3, 20-dione。

化合物5白色固体, 香草醛浓硫酸显棕黄色, [α]D20+84.35° (0.147, CHCl3), mp. 200~203 ℃。EI MS316 [M]+。结合NMR(21个碳: 4个季碳, 5个CH, 9个CH2, 3个CH3)确定其分子式为C21H32O2, 不饱和度6。NMR给出了2个孤立酮羰基:dC209.6 (s)和211.9 (s), 除此之外无任何不饱和信息, 故而确定该化合物具有4个环。同时NMR给出甾体类典型的18和19角甲基信息: (dH0.64, s, 3H; 1.01, s, 3H)。暗示化合物5也为孕甾烷类化合物。将化合物5与4对比, 发现其极为相似。只是比4少了一个三取代双键信号[dH5.74 (s,1H)dC171.0 (s)、124.0 (d)], 同时其中一个酮羰基的化学位移值明显向高场移动了12 ppm (5:dC211.9, s; 4:dC199.5, s), 说明其为孤立酮羰基。将5的NMR数据与5-3, 20-二酮孕甾烷对照(Macnevin et al, 2009), 二者基本一致, 故而鉴定化合物5结构为5-pregnan-3, 20-dione。

化合物6亦为白色固体, 紫外254 nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+45.95° (0.037, CHCl3), EI MS给出分子量316(316 [M]+), 结合NMR(21个碳: 4个季碳, 6个CH, 8个CH2和3个CH3), 确定其分子式为C21H32O2, 不饱和度6。将化合物6的NMR数据与4和5对照发现, 三者十分相似。与5对照只是多了一个三取代双键信息(dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 140.8, s)。而与4对比发现二者的差异在于少了一个共轭酮羰基信息(dC199.5, s), 同时双键的化学位移值有所变化(4:dH5.74, s, 1H;dC124.0, d; 171.0, s; 6:dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 140.8, s)。文献调研显示(Qi et al, 2008), 3-OH,D5,6类型的甾体类化合物的NMR数据为(dH5.35, s; 1H;dC121.8, d; 140.7, s)。故确定6的双键应该为D5,6类型。将6的NMR数据与20-酮孕甾烷对照(温燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴兴云等, 2011), 二者基本一致, 故确定6为3-pregnan-hydroxy-5-en-20-one。

化合物7白色固体, 紫外254nm下有暗斑, 香草醛浓硫酸加热显墨绿色。[α]D26+12.00° (0.05, MeOH)(Shingate et al. 2011), EI MS给出分子量318(318 [M]+), 结合NMR(21个碳: 3个季碳, 6个CH, 9个CH2和3个CH3)确定其分子式为C21H34O2, 不饱和度5。将化合物7的NMR数据与6对比, 发现二者相似。只是比6少了一个双键(dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 14.8, s), 多了一个连氧次甲基信息(dH3.59, m, 1H;dC71.2, d)。将7的NMR数据与3-羟基-5-20-酮孕甾烷对照(温燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴兴云等, 2011), 二者基本一致, 故而鉴定7为3-hydroxy-5-pregnan-20-one。

化合物8: 无色针状晶体, mp. 179~180℃, [α]D25−45.00° (1.0, C5H5N)(Van Minh et al, 2007)。结合NMR(3个季碳, 10个CH, 9个CH2, 7个CH3), 确定分子式为C30H50O, 不饱和度6。NMR中给出双键信号(dH5.34, br d, 4.0 Hz, 1H与dC140.8, s; 121.7, d), 这是5, 6位双键的典型特征;1H-NMR高场数据中(dH0.13, 1H, dd, 4.0Hz, 4.0Hz; 0.17, m, 1H; 0.23, 1H, dd, 8.0Hz, 8.0Hz; 0.45, dd, 1H, 4.0Hz, 4.0Hz), 是环丙烷边链的信号峰。除此外并无其它任何不饱和信息, 由此确定该化合物具有4个环。且1H-NMR中给出7个甲基信号: 3个连在季碳上的角甲基(dH0.66, s, 3H; 0.90, s, 3H; 1.01, s, 3H), 4个与次甲基相连的甲基(0.85, d, 3H, 6.0 Hz; 0.94, d, 3H, 6.0Hz; 0.95, d, 3H, 6.0Hz; 0.95, d, 3H, 6.0Hz)。将8 NMR数据与柳珊瑚甾醇对比(Ortega et al, 2008), 二者基本一致, 故确定8结构为柳珊瑚甾醇。

3 结果与讨论

所有化合物均首次从属柳珊瑚中得到。此研究结果为南海的进一步开发提供了物质结构基础, 丰富了柳珊瑚的化学成分多样性。化合物1~3属于断甾醇类化合物, 大多具有体外细胞毒活性(如K562, HL-60, A549, HCT-116和HeLa)(Liu et al, 2014)。2在3.00μg·mL-1条件下具有增加成骨细胞MC3T3-E1的生长、诊断碱性磷酸酶和矿化结节的活性(Van Minh et al, 2007)。构效关系研究发现(Liu et al, 2014), 此系列化合物在IC50值为1.09~8.12μg·mL-1时, 对人体白血病K562细胞具有细胞毒活性; 3-位的羟基是其细胞毒活性的基础, 6-位、11-位的羟基乙酰化能使细胞毒活性增强。化合物4~7从化学结构讲均属于孕甾酮类, 为天然来源的孕甾酮类化合物。此类化合物具有抗污损和抗细菌(对海洋来源的15株细菌菌株具有抑制其生长的作用)等生态和生物活性(Qi et al, 2008)。临床和临床前研究(Ortega et al, 2008)表明, 外伤性脑损伤在荷尔蒙孕酮类物质急性给药时, 能极大的减小其导致的脑水肿、炎症、组织坏死、编程性细胞死亡等不良后果, 然而其水溶性不佳成为限制其发挥治疗作用的障碍; 而天然得到的孕甾酮解决了其溶解性问题, 并在外伤性脑损伤(TBI)中发挥了重要的治疗作用。柳珊瑚甾醇生理活性实验(欧云付等, 2011)表明其具有明显的抗心律失常和减慢心率等作用。尽管文献报道此类化合物具有抗肿瘤、抗菌和抗污活性, 但在浓度为50.00μg·mL-1时, 所有单体化合物在克服非小细胞肺癌肿瘤耐药(NCI-H1975/GR)方面未表现出任何活性。目前生物污染给全球海运业带来巨大经济损失, 大多海洋生物附着在轮船、舰艇水体表面(如藤壶, 贻贝, 管虫和海藻等)给海运业上造成严重生物污染问题(Aiello et al, 2003)。目前常见防污剂中三丁基锡(TBI)最有效但同时也具有高毒性, 非选择性地杀死海洋生物和伤害非目标生物。有研究表明(Li et al, 2013)海洋生物可以产生自身去污成分, 如从柳珊瑚分离的萜类、类固醇和聚酮等是一种极好的来源无毒防污化合物。初步构效关系研究表明呋喃环部分对防污活性都很重要, 同时羟基的存在增强了它们的抗沉降活性(Li et al, 2013)。许多海洋生物(如柳珊瑚, 软珊瑚, 海绵和海藻)能有效地抵御掠食者, 竞争者和潜力病原体(Moritz et al, 2014), 能抑制海洋细菌的生长和藤壶幼虫的沉降(Qi et al, 2008)。总之, 在这项研究中我们首次从柳珊瑚中分离鉴定具有一系列生物活性的化合物, 值得进一步探索无毒天然防污化合物。

柴兴云, 胡静, 黄晖, 等, 2011. 小月柳珊瑚中孕甾烷类的化学成分研究[J]. 热带海洋学报, 30(1): 127–130. CHAI XINGYUN, HU JING, HUANG HUI, et al, 2011. Pregnane steroids from a gorgoniansp. in South China Sea[J]. Journal of Tropical Oceanography, 30(1): 127–130 (in Chinese with English abstract).

柴兴云, 唐力英, 雷辉, 等, 2012. 柳珊瑚化学成分与生物活性研究新进展[J]. 中国中药杂志, 37(5): 667–685. CHAI XINGYUN, TANG LIYING, LEI HUI, et al, 2012. Most advance on chemical and biological investigations of gorgonian octocorals[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 37(5): 667–685 (in Chinese with English abstract).

高程海, 方燕, 易湘茜, 等, 2013. 中国柳珊瑚萜类化合物研究新进展[J]. 广西科学院学报, 29(2): 108–113. GAO CHENGHAI, FANG YAN, YI XIANGXI, et al, 2013. Advances in studies on terpenoids and their bioactivities from Gorgonian[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences, 29(2): 108–113 (in Chinese with English abstract).

刘虹, 苏镜娱, 曾陇梅, 2004. 豆荚软珊瑚sp.中的次生代谢产物研究[J]. 中山大学学报(自然科学版), 43(1): 122–124. LIU HONG, SU JINGYU, ZENG LONGMEI, 2004. Studies on the secondary metabolites of the soft coralsp.[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 43(1): 122–124 (in Chinese with English abstract).

欧云付, 尹平河, 徐石海, 等, 2011. 南海圆形短指软珊瑚的化学成分[J]. 光谱实验室, 28(6): 3293–3297. OU YUNFU, YIN PINGHE, XU SHIHAI, et al, 2011. Chemical constituents in round short refers to soft coralfrom South China Sea[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 28(6): 3293–3297 (in Chinese with English abstract).

温燕梅, 漆淑华, 张偲, 2007. 南海脆灯蕊柳珊瑚化学成分的研究[J]. 热带海洋学报, 26(1): 73–77. WEN YANMEI, QI SHUHUA, ZHANG SI, 2007. Studies on chemical constituents of gorgonianfrom South China Sea[J]. Journal of Tropical Oceanography, 26(1): 73–77 (in Chinese with English abstract).

AIELLO A, ESPOSITO G, FATTORUSSO E, et al, 2003. Aplidiasterols A and B, two new cytotoxic 9,11-secosterols from the mediterranean ascidian[J]. Steroids, 68(9): 719–723.

BLUNT J W, COPP B R, KEYZERS R A, et al, 2014–2018. Marine natural products[J]. Natural Product Reports, 31(2): 160–258, 32(2): 116–211, 33(3): 382–431, 34(3): 235–294, 35(1): 8–53.

BOONANANWONG S, KONGKATHIP B, KONGKATHIP N, 2008. First synthesis of 3,16,20-polyoxygenated cholestanes, new cytotoxic steroids from the gorgonian[J]. Steroids, 73(11): 1123–1127.

CIMINO G, DE ROSA S, DE STEFANO S, et al, 1984. C-18 Hydroxy steroids from the Mediterranean gorgonian[J]. Experientia, 40(3): 246–248.

GARRIDO L, ZUBÍA E, ORTEGA M J, et al, 2000. Isolation and structure elucidation of new cytotoxic steroids from the gorgonian[J]. Steroids, 65(2): 85–88.

GUTIÉRREZ M, CAPSON T L, GUZMÁN H M, et al, 2005. Leptolide, a new furanocembranolide diterpene from[J]. Journal of Natural Products, 68(4): 614– 616.

KEYZERS R A, GRAY C A, SCHLEYER M H, et al, 2006. Malonganenones A-C, novel tetraprenylated alkaloids from the Mozambique gorgonian[J]. Tetrahedron, 62(10): 2200–2206.

KINGSLEY R J, CORCORAN M L, KRIDER K L, et al, 2001. Thyroxine and vitamin D in the gorgonian[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 129(4): 897–907.

KSEBATI M B, CIERESZKO L S, SCHMITZ F J. 1984. 11, 12-Epoxypukalide, a furanocembranolide from the gorgonian[J]. Journal of Natural Products, 47(6): 1009–1012.

LI YONGXIN, WU HUIXIAN, XU YING, et al, 2013. Antifouling activity of secondary metabolites isolated from Chinese marine organisms[J]. Marine Biotechnology, 15(5): 552–558.

LIU MIN, SHAO CHANGLUN, CHEN MIN, et al, 2014. Bioactive 9,11-secosteroids from gorgoniancollected from the South China Sea[J]. Chemistry & Biodiversity, 11(7): 1109–1120.

MACNEVIN C J, ATIF F, SAYEED I, et al, 2009. Development and screening of water-soluble analogues of progesterone and allopregnanolone in models of brain injury [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 52(19): 6012–6023.

MIRALLÈS J, BARNATHAN G, GALONNIER R, et al, 1995. New branched-chain fatty acids from the Senegalese gorgonian(white and yellow morphs)[J]. Lipids, 30(5): 459–466.

MORITZ M I G, MAROSTICA L L, BIANCO É M, et al, 2014. Polyoxygenated steroids from the octocoralandevaluation of their cytotoxic activity[J]. Marine Drugs, 12(12): 5864–5880.

ORTEGA M J, ZUBÍA E, SÁNCHEZ M C, et al, 2008. Cembrane diterpenes from the gorgonian[J]. Journal of Natural Products, 71(9): 1637–1639.

PAULI G F, FRIESEN J B, GÖDECKE T, et al, 2010. Occurrence of progesterone and related animal steroids in two higher plants[J]. Journal of Natural Products, 73(3): 338–345.

QI S H, ZHANG S, YANG L H, et al, 2008. Antifouling and antibacterial compounds from the gorgoniansand[J]. Natural Product Research, 22(2): 154–166.

SHINGATE B B, HAZRA B G, SALUNKE D B, et al, 2011 Stereoselective synthesis and antimicrobial activity of steroidal C-20 tertiary alcohols with thiazole/pyridine side chain[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 46(9): 3681–3689.

VAN MINH C, CUONG N X, TUAN T A, et al, 2007. A new 9,11-secosterol from the Vietnamese sea soft coral,, increases the function of osteoblastic MC3T3-E1 cells[J]. Natural Product Communications, 2(11): 1095–1100.

Research on Sterols from

XIAO Xiji, DENG Yun, XIE Lufeng, ZHANG Qi, WEI Xia, YU Xin, ZHANG Cuixian

School of Pharmaceutical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006, China

Research was carried out on novel secondary metabolites fromcollected from the South China Sea. The secondary metabolites were isolated by silica gel column chromatography, ODS, Sephadex LH-20, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). The structures of compounds were identified by nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), mass spectrum (MS), and literature analysis. Eight sterols were obtained and elucidated as follows: 3, 6, 11-trihydroxy-24-methyl-5-chloest-9, 11-seco-7-en-9-one (1); 3, 6, 11-trihydroxy-24- methyl-5-chloest-9, 11-seco-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-tri- hydroxy-5-chloest-9, 11-seco-7, 22()- dien-9-one (3); pregnan- 4-en-3, 20-dione (4); 5-pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy- pregnan-5-en-20-dione (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); and Gorgosterol (8). All the sterols were first obtained from.

; secondary metabolites; secosterols; identification

date: 2018-11-21;

date: 2019-01-04.

National Natural Science Foundation (81741160); Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2015A020216017, 2017A020217008); The Fire Plan Project of the Guangzhou University of Chinese Medicine (XH20170110); Open Subject of State Key Laboratory of Marine Resources Utilization in the South China Sea of Hainan University (2016003); Natural Science Foundation of Guangdong Province (2014A030313411)

ZHANG Cuixian. E-mail: zhangcuixian@aliyun.com

O629.7; P735

A

1009-5470(2019)04-0064-6

10.11978/2018125

http://www.jto.ac.cn

2018-11-21;

2019-01-04。

孙淑杰编辑

国家自然科学基金项目(81741160); 广东省科技计划(2015A020216017、2017A020217008); 广州中医药大学“薪火计划”重点项目(XH20170110); 海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室开放课题(2016003); 广东省自然科学基金项目(2014A030313411)

肖细姬(1983—), 女, 助理实验师, 研究方向: 药效物质基础研究。E-Mail: xiaoxiji@gzucm.edu.cn

张翠仙(1975—), 女, 教授, 博士生导师, 研究方向: 天然药物化学。E-Mail: zhangcuixian@aliyun.com

Editor: SUN Shujie